Trusa de instrumente. Cercetare proteomică în biologie și medicină

Genomica funcțională este strâns legată și de fapt se suprapune cu cea mai nouă direcție a biologiei, numită „ proteomica" - știința proteomilor. Cuvântul „proteome” este format din cuvântul „proteină” (proteină) și sfârșitul cuvântului „genom”, astfel încât numele în sine pare să îmbine „proteină” și „genom” (ADN). Acest lucru subliniază relația lor strânsă Cu toate acestea, între genomică și proteomică, între genom și proteom, există o diferență fundamentală care dă naștere unor metode de cercetare complet noi, strategii noi.

Proteom- un concept dinamic, în timp ce genomul este stabil și constant, altfel ar fi imposibil să se transmită proprietăți ereditare din generație în generație, să se asigure conservarea speciilor etc. Variabilitatea genomului apare întotdeauna pe fondul stabilității sale ridicate și nu o anulează în niciun fel. Proteomul este un set de proteine ​​ale unei celule date într-o fază dată a dezvoltării sale la un moment dat în timp, de exemplu. mai mic decât genomul din punct de vedere al informaţiei totale. În orice celulă a corpului uman, toate cele aproximativ 80 de mii de gene nu funcționează niciodată; doar o parte dintre ele funcționează - uneori mai puțin, alteori mai mult. Deși este încă dificil de dat cifre exacte, într-o celulă specializată obișnuită, de exemplu, într-o celulă hepatică sau pulmonară, probabil nu sunt prezente simultan mai mult de 10 mii de proteine ​​și în cantități puternic diferite - de la câteva molecule per celulă la câteva procente din totalul veverițelor celulare. Setul de proteine ​​se modifică constant în funcție de faza diviziunii celulare, specializarea țesuturilor celulei, stadiul diferențierii acesteia, dacă aparține celulelor normale sau maligne, starea de stres sau repaus, expunerea la substanțe extracelulare fiziologic active și asa mai departe la infinit. Prin urmare, „portretul” proteic al unei celule depinde de mulți factori și influențe și este supus unor modificări aproape continue, ceea ce face studiul acesteia deosebit de dificil.

Există un „buchet” de tehnologii proteomice; fiecare are propriile sale avantaje și dezavantaje. Să ne concentrăm pe cele două cele mai eficiente. Un amestec complex de proteine ​​extrase dintr-o celulă poate fi separat pe un purtător (de obicei un gel de poliacrilamidă) în două direcții: într-una, proteinele vor fi separate după dimensiune (greutate moleculară), în cealaltă, prin sarcină electrică (punct izoelectric). ). Rezultatul este o hartă bidimensională care conține multe sute de puncte, fiecare dintre ele corespunde uneia sau mai multor proteine.

Dacă un cercetător este interesat de un anumit grup de proteine, acesta poate fi identificat pe o „hartă” și supus separării repetate în condiții ușor modificate, cu rezoluție mai mare. Băncile de date conțin acum informații despre multe tipuri de celule diferite ale căror proteine ​​au fost supuse separării electroforetice bidirecționale. Calculatorul poate compara astfel de „hărți de proteine” bidimensionale și poate izola ceea ce este același în aceste tipuri de celule și în ce proteine ​​diferă.

Metoda hărții 2D este îmbunătățită în mod continuu, iar majoritatea petelor proteice individuale care sunt vizibile pe aceste hărți au fost deja identificate sau sunt în curs de a fi identificate.

Cea mai modernă metodă de identificare a proteinelor este aceea că proteina studiată este supusă scindării în fragmente (peptide) folosind una sau alta enzimă (protează). Peptidele rezultate sunt apoi separate, de obicei folosind cromatografie de înaltă presiune, apoi fiecare peptidă individuală este plasată într-un spectrometru de masă și se determină masa sa. Compararea rezultatelor obținute cu cele disponibile în bazele de date de proteine ​​permite ca o proteină să fie identificată în mod fiabil dacă structura ei este cunoscută. Pentru o proteină necunoscută, această metodă ajută la găsirea „rudelor” și, prin urmare, la formularea unei idei preliminare a funcției sale posibile.

Variabilitatea proteomului este asociată nu numai cu faptul că, la un moment dat, o parte a genelor funcționează, iar într-un alt moment - alta. Compoziția proteinelor este foarte dependentă de procesele care au loc pe calea de la ADN la ARN mesager (ARNm). Aici, majoritatea produselor genice primare (ARN) sunt supuse așa-numitei „splicing alternative”, a cărei esență este că înainte de formarea ARN-ului mesager matur, diferite părți ale moleculei sunt îndepărtate din acesta. Ca rezultat, o genă poate da naștere la multe proteine ​​care diferă în structura primară. Astfel, a devenit evident că una dintre vechile dogme ale biochimiei și biologiei moleculare - „O genă - o enzimă” - trebuie modernizată. Pentru multe cazuri, următoarea formulă este adevărată: „O genă, multe proteine”.

În acest sens, trebuie remarcat faptul că, după sinteză, proteinele suferă multe modificări chimice (modificări), care creează enorma lor diversitate, deși au fost inițial codificate de o singură genă. Astfel de modificări includ reacții de fosforilare, acetilare, metilare, glicozilare și multe altele. Dacă luăm în considerare că există multe locuri pe o proteină mare unde pot apărea aceste modificări, este ușor de imaginat ce varietate aproape infinită de forme ale aceleiași molecule proteice poate apărea. Marea majoritate a modificărilor afectează în mod semnificativ activitatea biologică a unei anumite molecule de proteine, precum și capacitatea acesteia de a interacționa cu alte molecule de proteine. Ca rezultat, ajungem la concluzia că atunci când, să zicem, 10% din toate genele lucrează într-o celulă - să zicem, 8 mii - atunci numărul de proteine ​​diferite poate depăși această valoare de 10 ori. Cercetătorii ghiciseră anterior că o astfel de situație era posibilă, totuși, abia acum își dau seama cu adevărat de adevărata ei amploare.

O ramură extrem de importantă a proteomicii, desigur, ar trebui considerată studiul interacțiunilor proteină-proteină și proteină-acid nucleic. În timpul vieții unei celule, aproape fiecare proteină, în timpul funcționării sale, interacționează cu o varietate de macromolecule, precum și cu liganzi cu molecul scăzut.

Pentru a studia interacțiunile proteină-proteină în anul trecut Metoda așa-numitelor „hibrizi dubli de drojdie” a devenit larg răspândită. Folosind inginerie genetică, se creează un construct care constă dintr-o secțiune ADN care interacționează cu un factor de transcripție și o secțiune ADN care codifică o „genă reporter”, care, la rândul său, codifică o proteină enzimatică a cărei activitate este ușor de măsurat. Un factor de transcripție este format din două dominante și funcționează numai atunci când dominantele interacționează între ele. Dacă vrem să aflăm dacă două proteine ​​aflate în studiu interacționează între ele, trebuie să izolăm factorul de transcripție și să atașăm proteina de interes la fiecare dintre dominante. Când interacționează, factorul de transcripție își va restabili activitatea, ceea ce va permite „genei reporter” să funcționeze, iar apoi veți detecta activitatea „proteinei reporter”. Dacă proteinele studiate nu interacționează, proteina-enzima nu se formează.

Aplicarea sistemului cu doi hibrizi la proteinele oamenilor și ale altor organisme a făcut posibilă demonstrarea faptului că există un număr mare de contacte proteină-proteină de diferite tipuri și, în plus, descoperirea multor interacțiuni proteină-proteină necunoscute anterior. Aceste informații sunt extrem de importante pentru identificarea componentelor căilor de semnalizare din celulă. De regulă, transmiterea semnalelor de la suprafața celulei către nucleu implică „proteine ​​intermediare”, care se găsesc adesea în concentrații minuscule în celulă, astfel încât analiza căilor de semnalizare este foarte dificilă pentru experimentatori. Descoperirea interacțiunilor proteină-proteină a schimbat dramatic situația.

Atunci când se analizează interacțiunile proteină-acid nucleic, metodele de „reticulare chimică” a acestor componente sunt utilizate pe scară largă (de exemplu, personalul academicianului A.A. Bogdanov a identificat multe interacțiuni importante în interiorul particulelor ribozomale, unde biosinteza proteinelor are loc în celulă).

O altă metodă convenabilă este modificarea mobilității electroforetice în timpul formării complexe, care a fost utilizată pentru a analiza o varietate de contacte ADN-proteină și ARN-proteină. Versiunea originala Această metodă în combinație cu „reticulare chimică” a fost dezvoltată de academicianul A.D. Mirzabekov și folosit pentru a dezvălui structura nucleozomului - o unitate structurală elementară constând din ADN și proteine ​​​​histone, din care sunt construiți toți cromozomii.

În prezent, la nivelul centrelor academice ale diferitelor institute de cercetare din Rusia, țările CSI, Europa de Vest, SUA și Canada, rezultatele platformelor științifice tehnologice pentru cercetare biomedicală și farmaceutică sunt dezvoltate și introduse în clinică. Dacă harta genomică umană este în esență aceeași pentru toate celulele umane - 23 de cromozomi cu același set de gene, cu excepția a 14 celule germinale - atunci, în cazul hărții proteomice umane, este complet lipsit de sens să vorbim despre generalitatea sa. : fiecare celulă, fiecare țesut, fiecare...

Distribuiți-vă munca pe rețelele sociale

Dacă această lucrare nu vă convine, în partea de jos a paginii există o listă cu lucrări similare. De asemenea, puteți utiliza butonul de căutare

INTRODUCERE……………………………………………………………………...3

1 CONCEPTE, PRINCIPII ȘI DIRECȚII DE PROTEOMICE..5

2 HARTARE PROTEOMICA………………………………….7

3 ABORDAREA INTERDISCIPLINARĂ ÎN UTILIZAREA CERCETĂRII PROTEOMICE INOVATIVE…………………12

CONCLUZIE………………………………………………………………….15

LISTA DE REFERINȚE…………...17

INTRODUCERE

În prezent, există o revoluție a ideilor despre etiologia, patogeneza și terapia bolilor umane, care este asociată cu progresele în domeniul biologiei și geneticii moleculare, medicinei moleculare și farmacologiei.

S-au făcut progrese semnificative în înțelegerea structurii și funcției ADN-ului, ARN-ului, proteinelor, replicarea și funcționarea genomului, transcripția inversă, modificarea, repararea și recombinarea ADN-ului, transcripția și traducerea ARNm în celulele pro- și eucariote. Numeroase studii bazate pe noi metode bioanalitice au clarificat principalele căi de reglare a expresiei genelor. Tehnologiile ADN recombinant au fost studiate în detaliu. În prezent, studiul bazelor fizico-chimice ale dezvoltării bolilor umane ereditare și semnificative social (ateroscleroză, oncopatologii, diabet zaharat, infecții intracelulare, boli neurodegenerative etc.) a primit o dezvoltare puternică.

În era post-genomică, se pune problema implementării practice a dezvoltărilor fundamentale în domeniul biologiei moleculare, medicinei și farmacologiei. În același timp, o reflectare a funcționării genomului sunt evenimentele postgenomice asociate cu sinteza a numeroase proteine, al căror studiu primește acum o atenție specială în cadrul unui studiu separat. direcție științifică proteomica. Dezvoltarea cercetării proteomice este imposibilă fără construirea de algoritmi și metode de analiză, crearea unei baze de date care să facă posibilă elucidarea mecanismului de funcționare a textelor biologice și dezvoltarea efectelor farmacologice vizate (biotransformare).

Problemele conexe de genomică și proteomică, farmacogenomică și biotransformatică sunt implementate pe baza unor soluții metodologice unice și platforme tehnologice.

În prezent, la nivelul centrelor academice, diverse institute de cercetare din Rusia, țările CSI, Europa de Vest, SUA și Canada, rezultatele platformelor tehnologice științifice pentru cercetare biomedicală și farmaceutică sunt dezvoltate și introduse în clinică.

Scopul practicii este de a învăța elementele de bază ale proteomicii și cartografierii proteomice

Scopul practicii este de a consolida și aprofunda cunoștințele teoretice dobândite în timpul procesului de învățare; stăpânește metode de lucru cu literatura de specialitate; colectează materiale specifice în conformitate cu întrebările recomandate; formalizează rezultatele obținute în timpul stagiului.

1 CONCEPTE, PRINCIPII ȘI DIRECȚII DE PROTEOMICE

Începutul secolului XXI este marcat de începutul erei proteomicii. Acest termen provine din alte două concepte binecunoscute din biochimie: „PROTEINE” și „genOMe” și a fost folosit pentru prima dată în 1995.

Desigur, genomica nu va dispărea, se va dezvolta la aceeași, și poate chiar mai rapidă, viteză, dar este clar că centrul cercetării post-genomice va fi transferat în domeniul inventarierii și elucidării hărții proteomice umane. La prima vedere, problema pare complet de nerezolvat. Dacă harta genomică umană este în esență aceeași pentru toate celulele umane (acestea sunt 23 de cromozomi cu același set de gene, cu excepția a 14 celule sexuale), atunci în cazul hărții proteomice umane este complet lipsit de sens să vorbim despre generalitatea sa: fiecare celulă, fiecare țesut, fiecare fluid biologic trebuie să aibă propria hartă proteomică. Deși fiecare celulă poate avea aproximativ 100.000 de gene funcționale, numeroase reacții de modificare pot crește numărul de proteine ​​dintr-o celulă la 10 × 20 milioane.

În acest sens, există în prezent două definiții ale proteomicii: una îngustă, care poate fi numită proteomică structurală, și una mai largă, care include atât părțile structurale, cât și funcționale ale proteomicii. În sensul restrâns al cuvântului, proteomica este știința care se ocupă cu inventarierea proteinelor folosind utilizarea combinată a metodelor: electroforeză bidimensională (electroforeză 2D), analiza spectrometrică de masă (MS) a greutății moleculare și a secvenței proteinelor. a materialului biologic separat prin electroforeză, urmată de analiza rezultatelor folosind metode bioinformatice. În esență, proteomica structurală este o combinație de electroforeză 2D, spectrometrie de masă și bioinformatică. Și dacă capacitățile de rezolvare ale electroforezei bidimensionale sunt cunoscute de mult timp, de la prima lucrare a lui OFarrell în 1975, capacitățile analizei MS de a determina foarte rapid greutatea moleculară și secvența lanțurilor polipeptidice au devenit clare abia recent. . S-au dezvoltat atât de repede încât acum unele companii s-au creat deja sisteme automatizate pentru a determina greutatea moleculară și secvența proteinelor, lucrând la niveluri de concentrație fenomolară și atomomolară. Folosind o combinație a acestor metode, este posibilă crearea unei hărți proteomice a oricărui material biologic, care reprezintă manifestarea fenotipică a genomului unei celule, țesuturi sau chiar un întreg organ. Într-un sens mai larg, termenii de analiză proteomică, sau proteomică, pot fi folosiți nu numai pentru a inventaria proteinele unui obiect biologic, ci și pentru a controla modificarea post-translațională reversibilă (PTM) a proteinelor de către enzime specifice, cum ar fi: fosforilarea , glicozilare, acilare, frenilare, schele etc. .d. .

În prezent, mai mult de 300 de tipuri diferite de modificări post-translaționale au fost caracterizate folosind proteomică.

Dezvoltarea intensivă a analizei MS a contribuit la apariția în ultimii 5-7 ani a unui întreg grup de domenii de cercetare proteomică (Fig. 1), dintre care cele mai multe au un accent biomedical, cu toate acestea, baza fundamentală astăzi rămâne încă cea structurală. și proteomica funcțională.

Politicile majorității țărilor din Uniunea Europeană, Rusia și țările CSI sunt, într-o măsură sau alta, legate de dorința naturală a populației de a trăi în conformitate cu standardele internaționale de calitate. Termeni precum „zonă ecologică curată” sau „produs ecologic”, precum și tot felul de cuvinte cu prefixul „euro-”, care s-au stabilit ferm în viața de zi cu zi, din păcate, în cele mai multe cazuri, nu au niciun fel real. conţinut. Cu toate acestea, standardele dorite de calitate a vieții stabilite în multe țări sunt rezultatul unor procese complexe care afectează cultural, social și aspecte legale dezvoltarea acestor state.

Figura 1 - Direcții moderne de analiză proteomică.

2 HARTARE PROTEOMICA

„Nu există doi indivizi în lume cu exact același metabolism. Diferențele individuale în activitatea enzimelor hepatice pot explica diferențele în răspunsul pacientului la medicamente.” A Garrod.

Importanța acestor cuvinte, apartenența, este greu de supraestimat în lumina progreselor recente ale medicinei moleculare. Citirea genomurilor unui număr de organisme, și mai ales a oamenilor, a marcat începutul erei tehnologiilor post-genomice. Impact semnificativ au avut impact asupra medicinei, permițând o analiză sistematică a mecanismelor moleculare de debut și dezvoltare a bolii. Cunoașterea acestor mecanisme ne permite să abordăm o nouă înțelegere calitativ a problemelor legate de prevenirea, diagnosticarea și tratamentul bolilor. Poate că, pentru prima dată în istoria sa, medicina a avut șansa să se apropie de statutul unei științe exacte, ocolind practica descriptivă de analiză a proceselor patologice care existau de secole.

Harta proteomică a bolii este o înțelegere a dezvoltării tabloului clinic al bolii sub formă de tulburări cantitative și calitative la nivelurile genomice, transcripționale, translaționale și post-translaționale ale funcționării organismului, i.e. la nivelul perturbărilor în compoziția și interacțiunea genelor din ADN, ARN, proteine, lipide, carbohidrați, precum și la nivelul metaboliților formați în celulă și care interacționează între ei.

Este important de subliniat că prezența unor astfel de tulburări indică adesea doar probabilitatea dezvoltării patologiei; prin urmare, este posibil, prin influențarea factorilor de mediu, să se reducă probabilitatea dezvoltării bolii dacă se iau măsuri preventive individuale adecvate.

Majoritatea bolilor, cum ar fi psoriazisul, schizofrenia, diabetul, sunt cauzate de o combinație de variante de gene ineficiente; cu alte cuvinte, ele sunt cauzate nu de tulburări unice, ci de un set de ele localizate în gene diferite. Dacă există o relație clară între un defect al unei gene și dezvoltarea patologiei, putem vorbi despre natura sa ereditară. Cu toate acestea, bolile ereditare reprezintă doar 2-5% din toate bolile; restul sunt asociate cu perturbarea unui întreg ansamblu de gene și, prin urmare, depind de profilul individual al multor substituții de un singur nucleotide și/sau de perturbarea expresiei unui grup de gene.

Harta de diagnostic proteomic: include SNP-uri asociate cu boli și SNP-uri responsabile de farmacocinetica și farmacodinamia medicamentelor, se formează pe baza cunoștințelor de genomică, proteomică, lipidomică, metabolomică, celomică, interactomică și folosind metode moderne de reacție în lanț a polimerazei, gaz cromatografie-spectrometrie de masă, specii moderne microscopie, soluții microfluidice și nanotehnologice pentru lucrări analitice.

Așa cum un pașaport civil servește acum ca document de identitate, un card de diagnostic proteomic, pe lângă identificarea personală, poate fi destinat pentru ca o persoană să aleagă un stil de viață adecvat. Pe baza acesteia, este posibil să se determine un tratament personalizat, aducând la viață standardul de aur al medicinei moderne: fiecare pacient își primește propriul medicament la momentul potrivit și în doza potrivită.

Diagnosticarea moleculară (proteomică) este un instrument de încredere pentru diagnosticarea stadiilor incipiente ale cancerului și în special pentru diagnosticarea „cancerelor tăcute” care nu se manifestă până când este prea târziu pentru a-l trata. Metodele tradiționale de verificare a cancerului presupun efectuarea unei biopsii, adică prelevarea unei microporțiuni de țesut. Cu toate acestea, din punct de vedere diagnostic, abordarea este absolut inacceptabilă, deoarece este dificil să ne imaginăm o persoană care, ca parte a unui examen medical de rutină, acceptă manipulări care se apropie de complexitatea și durerea unei operații chirurgicale. Aceasta înseamnă că cea mai accesibilă probă biologică pentru diagnostic a fost și va continua să fie un test de sânge proteomic.

La scară globală, proteomica se ocupă de inventarul tuturor proteinelor din organism. Aspectul medical al problemei este stabilirea unei corelații între setul de proteine ​​și debutul sau dezvoltarea bolii. Sarcina este similară cu genomica, în care relația dintre o boală și genom este determinată, dar este un ordin de mărime mai complex. Faptul este că există mult mai multe proteine ​​decât gene. Numărul acestora din urmă este estimat la 30-40 de mii, dar fiecare genă poate fi citită în multe (până la 200) variante alternative, ceea ce înseamnă că pot exista semnificativ mai multe proteine ​​- până la 6-8 milioane într-o celulă. Mai mult, o proteină specifică poate fi exprimată fie sub formă de copii moleculare unice, fie în cantități uriașe - există o gamă largă de concentrații de proteine ​​în celule și fluide biologice. Se poate susține că o situație similară apare atunci când se analizează ADN-ul, dar spre deosebire de ADN, proteinele nu pot fi produse în timpul reacției în lanț a polimerazei (PCR). Dar PCR este baza tuturor metodelor de lucru cu materialul genetic, deoarece vă permite să creșteți selectiv concentrația unei anumite molecule de ADN la un nivel care poate fi înregistrat de instrumente. În consecință, baza metodologică a proteomicii este o abordare în care sensibilitatea instrumentelor permite detectarea moleculelor individuale.

Există un proiect internațional „Human Proteome” (analog cu proiectul „Human Genome”) care intenționează să construiască o hartă proteomică a tuturor proteinelor umane. Obiectivele principale ale proiectului Human Proteome sunt compilarea hărților proteomice ale plasmei sanguine, ficatului și creierului, precum și cartografierea antigenică a genomului. În plus, un comitet special din cadrul proiectului ia în considerare inițiativele noi tehnologice. Centrul de proiect din Rusia participă la dezvoltarea unei hărți proteomice a plasmei sanguine și a ficatului și dezvoltă în mod activ noi abordări în domeniul nanotehnologiei.

Schema de analiză proteomică este simplă și se bazează pe realizările spectrometriei de masă moderne. O probă, cum ar fi plasma sanguină, este prelevată de la pacient într-o cantitate de puțin peste 1 ml. Evident, există multe proteine ​​diferite prezente în plasma sanguină. Separarea proteinelor se realizează prin electroforeză bidimensională, iar pe o electroforeză bidimensională, fiecare proteină apare ca un loc separat. Intensitatea acestuia corespunde nivelului de exprimare a proteinei, adică cantității sale. Analiza gelurilor face posibilă identificarea variațiilor individuale ale proteomului și estimarea parametrilor statistici pentru fiecare punct. Apoi, comparând electroferograma cu referința, este posibilă identificarea diferențelor asociate bolilor. Diferențele implică creșterea sau scăderea expresiei proteinelor, iar unele proteine ​​apar în plasma pacienților, în timp ce altele pot dispărea. Cu toate acestea, în stadiul analizei electroferogramelor bidimensionale, nu vorbim de fapt despre proteine ​​specifice, ci doar despre intensitatea petelor. Pentru a detecta (identifica) o proteină, o pată este excizată din gel, digerată, iar masele de fragmente (peptide) sunt detectate folosind spectrometria de masă.

Analiza proteomică implică o serie de proceduri de rutină care necesită multă muncă datorită faptului că numărul de proteine ​​analizate este mare, iar pentru semnificația statistică a rezultatului este necesară procesarea un numar mare de probe conform protocolului standard. Spectrele de masă colectate sunt transferate în programul de identificare a proteinelor. Profilul de masă obținut pe un spectrometru de masă, corespunzător fragmentelor peptidice ale unei proteine, face posibilă identificarea fără ambiguitate a acesteia prin căutarea corespondenței cu profile teoretice construite din proteine ​​ale genomului uman prin baze de date informatice specializate de pe Internet în modul online.

Era post-genomică deschide perspective largi pentru oamenii de știință ruși - aproximativ zece institute de cercetare ale Academiei Ruse de Științe, Academiei Ruse de Științe Medicale, Ministerul Rusiei Sănătății, Ministerul Rusiei Industriei și Științei și Universitatea de Stat din Moscova sunt în prezent. implicate în cercetare în acest domeniu, care au o bază hardware puternică cu personal tehnic calificat și, prin urmare, există potențial de dezvoltare ulterioară.

Pentru un medic, o hartă moleculară a unei boli este cheia pentru un diagnostic precis, un prognostic și o terapie țintită a bolii.

Pentru cercetător, o hartă moleculară a bolii de bază pentru noi descoperiri.

Figura 2 Harta moleculară (proteomică) și terapia umană

3 ABORDAREA INTERDISCIPLINARĂ A UTILIZĂRII CERCETĂRII PROTEOMICE INOVAtoare

Metodele avansate de diagnosticare medicală, aflate la intersecția științelor precum medicina, chimia, fizica și biologia, necesită o abordare sistematică a suportului informațional, care în acest caz ar trebui să asigure primirea, stocarea, prelucrarea și analiza rezultatelor cercetării.

Un laborator analitic interdisciplinar, care are o bază unică de echipamente de diagnostic medical de înaltă tehnologie, implică dezvoltarea de noi abordări ale suportului său informațional.

Baza de consiliere și diagnostic a laboratorului (centru) interdisciplinar cuprinde 6 blocuri științifice:

Studii proteomice și farmacoproteomice ale fluidelor și țesuturilor biologice ale corpului uman;

Studiul sensibilității individuale la medicamente;

Studiul bioechivalenței medicamentelor;

Dezvoltarea și studiile clinice de medicamente (Faza I);

Standarde de informații despre medicamente;

Studii farmacoepidemiologice și înregistrarea evenimentelor adverse la utilizarea medicamentelor.

Baza de consultanță și diagnostic reunește 6 departamente de metode de laborator, dotate cu echipamente avansate, de înaltă tehnologie:

Divizia HPLC/MS;

Divizarea noilor metode de cercetare electroforetică; Divizia PCR;

Divizarea metodelor de cercetare spectrofotometrică; Divizia MALDI-TOF-MS;

Divizia metodelor de cercetare imunochimică.

Rezultatele muncii tuturor blocurilor și diviziilor științifice de mai sus ale laboratorului sunt implementate la nivelul unității de consultanță pentru farmacologie clinică.

O platformă de informare pentru un laborator biomedical poate fi reprezentată ca o diagramă care combină trei blocuri: epidemiologie și farmacoepidemiologie, cercetare moleculară și baze de date.

Prin primirea unei cantități mari de informații clinice și date din studii epidemiologice în medicină folosind metode de cercetare de înaltă tehnologie, analiza și prelucrarea rezultatelor acestora, identificarea informațiilor primite, se formează baze de date, care sunt apoi utilizate prin tehnologia informației în toate domeniile activitate medicală și ajută la rezolvarea următoarelor probleme:

Dezvoltarea diagnosticului genetic și a terapiei genice;

Dezvoltarea metodelor de cercetare medicală și genetică în stadiul asistenței medicale primare;

Dezvoltarea principiilor farmacogenomice de diagnostic și terapie la prescrierea medicamentelor;

Dezvoltarea studiilor de echivalență farmaceutică și bioechivalență a medicamentelor; crearea unei bănci de date a polimorfismelor genetice și a tiparelor proteomice ale bolilor la indivizi și pacienți sănătoși.

CONCLUZIE

În prezent, progresul în biomedicină se datorează apariției unor noi metode de cercetare electroforetică, metode PCR, HPLC și MS. Utilizarea lor eficientă este asociată cu îmbunătățirea metodelor de preparare primară a probelor biologice pentru cercetare și dezvoltarea tehnologiilor celulare. Combinarea capacităților acestor metode contribuie la crearea unor platforme tehnologice unificate pentru implementarea programelor de cercetare fundamentală și aplicată în domeniul biomedicinei, farmacologiei și farmaciei.

Dezvoltarea de noi platforme tehnologice pentru cercetarea biomedicala si farmaceutica se bazeaza pe solutii nanotehnologice.

Descoperirile în domeniul decodării genomului uman, genomurilor microorganismelor patogene, precum și rezultatele interesante ale studiilor proteomice ale fluidelor și țesuturilor biologice ale corpului uman contribuie la apariția de noi agenți terapeutici pentru tratamentul multor boli semnificative din punct de vedere social. Potențialul puternic al descoperirilor în domeniul genomicii, proteomicii, metabolomicei pentru dezvoltarea terapiei genice și a noilor medicamente poate fi realizat pe deplin pe baza noilor platforme tehnologice și ținând cont de standardele moderne pentru implementarea acestora.

O sarcină importantă este crearea unei resurse de bioinformații cu drepturi depline, care va deveni o bază puternică pentru planificarea noilor dezvoltări experimentale, pentru interpretarea noilor rezultate ale studiilor genomice și proteomice, precum și pentru realizarea lucrărilor de farmacologie predictivă. Viitorul bioinformaticii este asociat cu dezvoltarea genomicii experimentale pentru pacienți cu dezvoltarea unui scenariu tipic de dezvoltare a corpului uman, începând din perioada postnatală, care ar trebui să revoluționeze medicina și asistența medicală.

Metodele avansate de diagnosticare biomedicală, care se află la intersecția științelor precum medicina, fizica și biologia, necesită o abordare sistematică a suportului informațional, care în acest caz ar trebui să faciliteze achiziția, stocarea, prelucrarea, analiza și schimbul de rezultate ale cercetării în cadrul a programelor multicentre.

BIBLIOGRAFIE

1. Archakov A.I. Bioinformatica, genomica și proteomica științele vieții secolului XXI // Număr. Miere. chimie. 2000. Nr 1. P. 13 18.

2. Archakov A.I. Ce fel de genomica? Proteomica//Problema. Miere. chimie. 2000. Nr 1. P. 19 24.

3. Gorbunova V.N., Baranov V.S. Introducere în diagnosticul molecular și terapia genică a bolilor ereditare. SPb.: Special. lit., 1997. 287 p.

4. Gorshkova Yu.V., Tregubov A.V. Tehnologii informaţionale în laboratorul de farmacocinetică aplicată//Probleme de standardizare în domeniul sănătăţii. 2005. Nr 11. P. 129 132.

5. Ivakhno S., Karnelyuk A. Proteomica cantitativă și aplicarea sa în biologia sistemelor // Biochimie. 2006. T. 71. Nr. 10. P. 1312 1327.

6. Sarvilina I.V., Karkishchenko V.N., Gorshkova Yu.V. Cercetare interdisciplinară în medicină. M.: Tehnosfera, 2007. P. 15 56.

7. Blackstone N.B., Green D.R. Evoluția mecanismului de sinucidere celulară//Bioessays. 1999. Vol. 21. Nr 1. str. 84 88.

8. Fiser A. Modelarea structurii proteinelor în era proteomică // Expert Rev. Proteomica. 204.Vol. 1. Nr. 1. pp. 97 110.

9. Gerber S.A., Rush J., Stemman O. Cuantificarea absolută a proteinelor și fosfoproteinelor din lizate celulare prin tandem MS//PNAS. STATELE UNITE ALE AMERICII. 2003. Vol. 100. Nr 12. str. 6940 6945.

10. Lander E.S. Array of Hope//Nature Genet. 1999. Vol. 21. pp. 3 4.

PAGINA \* MERGEFORMAT 2

Alte lucrări similare care vă pot interesa.vshm>
11839.		Studiu cuprinzător și caracterizare a caracteristicilor „roadmapping”	134,15 KB
	Obiectul de studiu: hărți rutiere și realizarea subiectului și utilizarea foilor rutiere. Foile de parcurs pot ajuta la concentrarea asupra planificării pe termen lung și la îmbunătățirea relațiilor și a independenței proiectelor, oferind baza pentru planificarea științifică și tehnică corporativă pentru a identifica nevoile punctelor forte și punctelor slabe ale corporației. Pentru fiecare linie de produse, foile de parcurs aliniază strategia de piață cu tehnologia și planurile de produs. Foile de parcurs vă ajută să vă concentrați pe planificarea pe termen lung...
11932.			17,7 KB
	Metoda creată de cartografiere electromagnetică la latitudini înalte folosind o sursă controlată puternică dezvoltată, cu frecvență extrem de joasă, care include metode de rezolvare a problemelor directe, recomandări pentru efectuarea experimentelor și metode moderne de interpretare a rezultatelor unor astfel de experimente, pare deosebit de relevantă pentru studiul regiunilor promițătoare, dar în același timp dificil de studiat la latitudini înalte. Rezolvarea problemei cartografierii electromagnetice la latitudini mari folosind...
13544.		Bazele biomecanice ale IVS	3,12 MB
	La o temperatură de 4 grade. Densitatea specifică a apei distilate la 4 grade. O creștere sau scădere a temperaturii apei duce la o modificare a greutății specifice. Prezența sărurilor sau a altor impurități în apă duce și la o creștere a greutății specifice.
10320.		Fundamentele managementului	86,1 KB
	Organizația este un sistem deschis de interacțiune și management al părților departamentelor de oameni etc. Managementul este procesul de distribuție și deplasare a cinci tipuri de resurse într-o organizație cu un scop prestabilit conform unui plan strategic pre-dezvoltat cu monitorizare continuă a muncii rezultate. Managementul adaptiv este managementul care se adaptează la noile condiții de mediu, schimbând planurile și modelele în funcție de situația în curs de dezvoltare. Există așa-numitele niveluri de control - acestea sunt niveluri din arborele ierarhic.
17816.		Bazele Linux	45,52 KB
	Conectați-vă la directorul dvs. de acasă. Pentru a face acest lucru, trebuie să rulați comanda cd Sunteți în directorul dvs. de lucru. Aici sunt stocate fișierele de utilizator și setările pentru programele pe care le utilizați. Creați următorul director și structură de fișiere, în directorul de start creați un director inform...
6066.		Fundamentele termodinamicii	40,26 KB
	Când un gaz se dilată, munca elementară pe care o face atunci când mișcă pistonul la o distanță infinitezimală este egală cu unde este forța care acționează din gaz asupra pistonului. Dacă presiunea gazului este zona pistonului, atunci și atunci. Produsul este evident egal cu creșterea volumului de gaz...
3779.		Bazele geoinformaticii	31,41 KB
	Manualul educațional conturează programul disciplinei, opțiunile pentru sarcinile de testare, subiecte pentru orele practice, întrebări pentru testare, literatura recomandată, exemple de implementare și cerințe pentru proiectarea lucrărilor de testare.
4449.		Bazele logice ale calculatoarelor	40,08 KB
	Bazele logica matematica; legi logice. Elemente logice de bază; logică. Jumătate viperă, viperă. Trigger.
11759.		Fundamentele statisticii juridice	1,34 MB
	În același timp, fenomenele și procesele juridice sunt luate în considerare în dinamica dezvoltării; relații care ne permit să identificăm relațiile cauză-efect ale dezvoltării; comparaţie şi comparaţie, ceea ce ne permite să stabilim specificul şi trăsăturile tipice ale fenomenului studiat. În stabilirea și cuantificarea tiparelor și interdependenței fenomenelor de masă, știința statistică se bazează pe legea numerelor mari, a cărei particularitate este că regularitățile și tiparele fenomenelor de masă pot fi detectate clar numai atunci când sunt masive...
14754.		BAZELE DREPTULUI FINANCIAR	12,06 KB
	Activitățile financiare ale statului și sistem financiar Republica Belarus. Controlul financiar în Republica Belarus. Legea bugetară a Republicii Belarus. Structura bugetară și sistemul bugetar al Republicii Belarus.

COMUNICAȚII ȘTIINȚIFICE

S.V. Suchkov12, D.A. Gnatenko1, D.S. Kostyushev1, S.A. Krynsky1, M.A. Paltsev3

1 Prima Universitate Medicală de Stat din Moscova numită după. LOR. Sechenov, Federația Rusă 2 Universitatea de Stat de Medicină și Stomatologie din Moscova numită după. A.I. Evdokimova, Federația Rusă

3 RRC „Institutul Kurchatov”, Moscova, Federația Rusă

Proteomica ca instrument fundamental pentru screening-ul preclinic, verificarea testelor și evaluarea aplicațiilor

Proteomica este o știință care studiază proteinele organismelor vii, funcțiile și interacțiunile acestora, iar astăzi este o componentă indispensabilă în crearea protocoalelor de diagnostic preclinic. În combinație cu realizările genomicii și bioinformaticii, utilizarea tehnologiilor proteomice este un instrument puternic pentru diagnosticarea precoce a bolilor, precum și evaluarea dinamică a cursului proceselor patologice (în special, pe fondul farmacoterapiei în curs). Articolul discută aspecte generale și specifice ale proteomicii bazate pe modele de boli cardiovasculare și oncologice.

Cuvinte cheie: proteomică, diagnostic, predicție, medicină translațională.

Introducere

Se știe că marea majoritate a modificărilor patologice în funcționarea celulelor, țesuturilor și organelor sunt însoțite de o abatere de la profilul proteic fiziologic al unui organism normal sănătos. În condiții moderne, analiza și predicția unor astfel de modificări ies în prim-plan atunci când se creează protocoale de screening preclinic (adică, identificarea „precursorilor” proteici ascunși și latenți ai bolii, precum și evaluarea eficacității metodelor de terapie aplicate). Căutarea, identificarea, separarea, determinarea cantitativă și calitativă a moleculelor proteice care joacă un rol în asigurarea sensibilității sau direct în formarea bolii sunt principalele sarcini ale proteomicii.

Proteomica este o știință care studiază compoziția proteică a obiectelor biologice, precum și proprietățile structurale și funcționale ale moleculelor de proteine. Sarcina sa este de a identifica și cuantifica proteinele individuale totale care sunt conținute în probele biologice (ser de sânge, lichid cefalorahidian, urină, biopsii) în diferite stadii de dezvoltare a bolii, precum și pe fundalul terapiei. Totalitatea tuturor proteinelor corpului, adică, de fapt, profilul său proteic, se numește „pro-teomă”.

Arsenalul tehnologic modern de proteomică

Se efectuează fracţionarea şi separarea proteinelor conţinute într-o probă biologică specifică

S.V. Suchkov1,2, D.S. Kostushev1, S.A. Krynskiy1, D.A. Gnatenko1, M.A. Paltsev3

1 I.M. Sechenov Prima Universitatea Medicală de Stat din Moscova, Federația Rusă 2 A.I. Evdokimov Universitatea de Stat Medical Stomatologic din Moscova, Federația Rusă 3 Institutul Științific al lui Kurchatov, Moscova, Federația Rusă

Proteomica ca instrument fundamental pentru screening-ul subclinic, verificarea testelor și evaluarea terapiei aplicate

Proteomica este o știință care studiază proteinele corpului, interacțiunile proteinelor și funcțiile lor biologice. Astăzi, este un partener esențial în stabilirea protocoalelor de diagnostic preclinic. Împreună cu alte științe, cum ar fi genomica și bioinformatica, va fi posibil să se diagnosticheze boli în cele mai timpurii etape înainte de debutul clinic sau să se câștige dinamica proceselor patologice din organism și răspunsul la terapia medicamentoasă. Acest articol discută aspecte generale ale proteomicii, precum și altele speciale pe baza modelelor de boli cardiace și cancer.

Cuvinte cheie: proteomică, diagnostic, predicție, medicină de traducere.

BULETINUL RAMS /2013/ Nr 1

prin electroforeză în gel de poliacrilamidă. Pentru identificarea proteinelor izolate, se utilizează o gamă largă de metode, dintre care trebuie evidențiate următoarele:

Microsecvențierea proteinelor;

Cromatografia lichidă presiune ridicata(HPLC) și rezoluție înaltă;

Metode de testare imunochimică folosind anticorpi monoclonali la determinanții antigenici individuali;

Spectrometrie de masa.

În ultimii ani, procedura de detectare a moleculelor de proteine ​​a fost optimizată semnificativ prin dezvoltarea în acest scop a unui panou larg de microbiocipuri cu diferite tipuri de detecție, de exemplu SELDI (surface-enhanced laser desorbtion/ionization) și/sau MALDI (matrix-assisted). desorbție/ionizare cu laser). Abordările de acest fel au făcut posibilă analiza simultană a până la 10.000 de proteine ​​individuale într-o probă, înregistrând în același timp schimbări minuscule ale concentrațiilor lor sub influența diverșilor factori. Ca urmare, dacă proteinele diferă în cel puțin unul dintre parametrii lor inerenți (încărcare totală a moleculei sau greutate moleculară), abordarea de mai sus face posibilă realizarea separării lor cu identificarea și caracterizarea ulterioară.

Una dintre cele mai promițătoare metode de identificare a proteinelor este spectrometria de masă, bazată pe formarea de particule ionizate ale analitului într-un spațiu vid, urmată de analiza raportului dintre masa ionilor și sarcina lor. Există diverse modificări ale spectrometriei de masă, care sunt împărțite în funcție de metodele de ionizare și detecție a particulelor utilizate. Un spectrometru de masă cu timp de zbor înregistrează ioni individuali, indicând raportul masa-încărcare al ionului (m/z), numărul de ioni și timpul de zbor al ionilor de la sursă la detectorul de ioni.

Metodele cromatografice au o rezoluție mai mică, permițând separarea proteinelor în funcție de proprietățile fizice ale moleculelor: sarcină (cromatografia cu schimb ionic), parametrii de hidrofobicitate (cromatografia hidrofobă), dimensiunea (filtrarea pe gel), capacitatea de a se lega la diferiți liganzi, de exemplu anticorpi ( cromatografia de afinitate). În aceste cazuri vorbim despre variante de cromatografie lichidă, deoarece Moleculele proteice nu există în faza gazoasă. În analiza proteomică, este adesea folosită o combinație de spectrometrie de masă și cromatografie lichidă (cromatografie-spectrometrie de masă): adică, de fapt, crearea și implementarea spectrometriei de masă a condus la un salt în dezvoltarea proteomicii.

În cele din urmă, metodele de proteomică includ analiza imunochimică folosind anticorpi monoclonali la determinanții antigenici individuali, liniari și dependenți de conformație, incluzând un număr de epitopi criptici.

Un rol important atunci când se lucrează cu secțiuni de țesut îl joacă metodele de cercetare imunohistochimică bazate pe interacțiuni specifice antigen-anticorp. Metodele imunohistochimice sunt foarte sensibile și specifice, permițând determinarea aproape oricărui antigen de interes (sfera de aplicare a metodei este limitată doar de biblioteca de anticorpi disponibilă).

Detectarea anticorpilor legați se realizează folosind enzime sau etichete fluorescente. În practica clinică, etichetele enzimelor sunt mai frecvente de la metoda imunofluorescenței, deși

și este mai sensibil și mai specific, dar necesită echipamente scumpe. În plus, coloranții fluorescenți au o perioadă de valabilitate scurtă. Unele tehnici presupun utilizarea de purtători polimerici pentru anticorpi, ceea ce crește sensibilitatea reacției.

Etapa finală a unei astfel de cercetări intensive în muncă și în mai multe etape este identificarea proteinelor folosind baze de date (bioinformatică).

Bioinformatica, din perspectiva științei aplicate, permite nu numai să stocheze, să analizeze și să proceseze cantități enorme de date necesare procedurilor științifice și de diagnosticare, dar este și capabilă să obțină informații despre proprietățile funcționale ale anumitor molecule de proteine ​​pe baza unor date despre structura genomului. Astfel, fără a avea practic informații despre interacțiunea grupurilor de molecule între ele, funcțiile și proprietățile lor, în unele cazuri este posibil să se determine în mod fiabil, cu un grad ridicat de probabilitate, caracteristicile obiectului studiat.

Proteomica ca fundament pentru cercetare științifică cu implementarea ulterioară a rezultatelor în practica clinică în cadrul principiilor și obiectivelor medicinei translaționale

Cercetarea necesită adesea analiza unui număr mare de mostre similare. Între timp, fiecare studiu necesită costuri de material și timp, care pot fi minimizate prin metoda matricei de țesut, care implică crearea de biblioteci de mostre de țesut cu posibilitatea ulterioară de examinare simultană (pe un singur pahar) a mai multor secțiuni. Secvența tipică de operații pentru cercetare de acest fel este următoarea:

Prelevarea de probe (celule, țesut, lichid biologic);

Pregătirea probei (liza celulară, extracția proteinelor);

Electroforeză în gel de poliacrilamidă bidimensională;

Apariția petelor proteice pe gel;

Analiza electroferogramei (numărul de puncte, localizarea acestora);

Izolarea zonelor de gel care conțin pete proteice individuale;

Scindarea proteinelor individuale (tripsinizare) direct în gel;

Analiza spectrometrică de masă (determinarea secvențelor de aminoacizi ale fragmentelor de proteine ​​individuale);

Identificarea fiecărei proteine ​​și măsurarea concentrației acesteia, documentarea, prelucrarea rezultatelor;

Interpretarea datelor obtinute folosind metode bioinformatice - analiza bazelor de date, obtinerea unui profil diferential al proteinelor.

Folosind această procedură, au fost deja descoperiți noi markeri proteici și s-au obținut rezultate impresionante în domeniul proteomicii și oncoproteomicii cardiovasculare.

Aspecte particulare ale proteomicii

Cele două tipuri principale de proteomică sunt structurale și funcționale. Primul studiază

COMUNICAȚII ȘTIINȚIFICE

structura proteinelor individuale, în timp ce al doilea le consideră în interacțiune cu alte proteine, explorând modificările conformaționale, biochimice și funcționale care apar. Setul de toate proteinele celulare care interacționează cu o moleculă specifică de proteină țintă se numește „interactom”.

Scopurile primare de diagnostic sunt servite în primul rând de proteomica structurală, în timp ce proteomica funcțională este mai mult o cale de cercetare științifică, precum și baza pentru dezvoltarea de medicamente fundamental noi care funcționează cu ținte farmacoterapeutice specifice și individuale la nivel celular și molecular.

Proteomica plasmei sanguine

Dintre toate țesuturile corpului, plasma sanguină reflectă cel mai bine compoziția proteinelor: proteomul plasmatic include aproximativ 1/10 din toate proteinele prezente în organism. Printre proteinele prezente în plasmă se numără:

Proteinele care funcționează în plasmă;

Imunoglobuline;

Hormoni;

Citokine;

Proteine ​​care trec tranzitoriu prin plasmă;

Proteine ​​intracelulare care intră în plasmă în timpul

distrugerea sau creșterea permeabilității celulare;

Proteine ​​care sunt absente în mod normal și secretate de celulele maligne;

Proteine ​​străine.

Cel puțin 1/2 din proteinele plasmatice există sub formă de complexe multiproteice. Cu ajutorul etichetelor moleculare speciale introduse în molecula de proteină, este posibilă izolarea și izolarea unor astfel de complexe în scopul studierii lor ulterioare pentru caracteristicile unui anumit interactom.

Până în prezent, au fost identificate mai mult de 10.000 de proteine ​​plasmatice pe baza analizei spectrometrice de masă a uneia sau două peptide din fiecare proteină și mai mult de 3.000 de proteine ​​pe baza identificării a două sau mai multe peptide. Aproape 900 de proteine ​​plasmatice au fost identificate cu o încredere de 95%.

Posibilitățile oferite de analiza proteomică a plasmei sanguine sunt foarte atractive. Cu toate acestea, plasma ca probă standard de testare are, de asemenea, o serie de dezavantaje semnificative. Acestea includ o împrăștiere foarte mare (până la 10 ordine de mărime) în concentrațiile de proteine ​​și predominanța printre acestea de o semnificație diagnostică mică. Când se studiază modificările proteomului plasmatic, de exemplu în bolile cardiovasculare, trebuie mai întâi să găsim o modalitate de a separa aceste proteine ​​neimportante, ceea ce reprezintă o provocare semnificativă. Prin urmare, sensibilitatea și specificitatea optime ar fi studierea unei probe obținute dintr-o biopsie a organului țintă, care, totuși, nu este întotdeauna aplicabilă.

Trebuie remarcat faptul că, în ciuda cercetărilor intense în acest domeniu, rata introducerii de noi biomarkeri în practica clinică rămâne scăzută. Acest lucru se explică atât prin motive obiective, cât și subiective. Una dintre ele ar trebui considerată o abordare predominant empirică a organizării cercetării fără o justificare teoretică adecvată, precum și dezvoltarea insuficientă a conexiunilor infrastructurale între centrele de cercetare, lipsa unei nomenclaturi unificate și problemele de sistematizare a datelor disponibile. Date faptice în mare parte

cel puțin să rămână împrăștiate, deoarece ritmul acumulării lor depășește capacitățile științei de a le integra.

Proteomica cardiovasculară

Această secțiune de proteomică este una dintre cele mai intens dezvoltate. Au fost deja create baze de date pe sute de proteine ​​ale proteomului miocardic, ale căror niveluri se modifică în patologiile cardiovasculare cronice și acute. Cel mai mare progres a fost realizat în studiul cardiomiopatiei dilatative. Cu această boală, conținutul a peste 100 de proteine ​​se modifică, care pot fi împărțite în 3 grupuri principale:

Proteine ​​asociate cu energie și metabolism;

proteine ​​inductibile de stres;

Proteine ​​care asigură funcții contractile

și formarea citoscheletului.

Aceste rezultate sunt pe deplin în concordanță cu ideile moderne despre patogeneza cardiomiopatiei dilatative.

Progresul în studierea patogenezei bolii coronariene și a insuficienței cardiace cronice nu este atât de semnificativ. Nu este întotdeauna posibilă modelarea adecvată a acestor tipuri de patologii: unele rezultate obținute pe modele animale nu sunt în concordanță cu cele la om. Majoritatea rezultatelor fiabile sunt legate de rolul așa-numitului în dezvoltarea și prevenirea bolilor coronariene și a insuficienței cardiace cronice. proteine ​​de șoc termic (Hsp 27). O atenție deosebită este acordată studiului proteomului în sindromul de reperfuzie. După leziunea de reperfuzie, sunt detectate modificări în structura proteinelor contractile: MLC-2 (lanțul ușor de miozină 2), toate cele trei proteine ​​ale complexului troponin. Mecanismele de semnalizare implicate în patogeneza sindromului de reperfuzie sunt în curs de studiu, deși imaginea completă a interacțiunilor proteinelor nu a fost încă pe deplin stabilită. Au fost efectuate studii pentru a studia fenomenul de precondiționare la distanță a miocardului înainte de leziunea ischemică, când o stare hipoxică este creată mai întâi în alt organ și apoi în inimă. Acest lucru reduce daunele de reperfuzie. Cu toate acestea, până în prezent nu a fost posibil să se identifice molecule candidate pentru rolul de mediatori umorali ai precondiționării.

Studierea proteomicii aterosclerozei este dificilă datorită heterogenității funcționale semnificative a fenotipului țesutului endotelial. S-au obţinut însă modele ale profilului proteic al plăcilor de ateroscleroză, în care sunt detectate modificări ale conţinutului de proteine ​​precum Hsp27, cristaline, factor de necroză tumorală a, catepsine, peroxiredoxine etc., aproximativ 80 de proteine ​​în total. Pentru a crea biomarkeri ai aterosclerozei, se propune studierea profilurilor proteinelor plasmatice asociate cu inflamația. De asemenea, se studiază secreția de proteine ​​de către plăcile aterosclerotice in vitro.

În insuficiența cardiacă cronică, singurul biomarker util clinic este peptida B-natriuretică. În ceea ce privește boala coronariană, numărul biomarkerilor este mult mai mare: troponine cardiace, creatin kinaza etc. Cu toate acestea, conținutul acestora crește abia în stadiile ulterioare ale ischemiei, astfel că se lucrează la căutarea unor noi biomarkeri care să permită diagnosticarea stadiilor incipiente ale acesteia. Un alt domeniu de interes sunt biomarkerii specifici ischemiei (mai degrabă decât necrozei miocardice). În prezent, există un singur astfel de marker - albumina modificată de ischemie (ischemic-

BULETINUL RAMS /2013/ Nr 1

albumină modificată, IMA). Cu toate acestea, specificitatea sa scăzută face dificilă utilizarea în afara unui complex cu biomarkeri tradiționali.

Studierea proteomului cardiac ridică provocări semnificative. Cea mai precisă metodă de analiză ar fi o biopsie, dar este dificil de efectuat. În cazul studierii plasmei sanguine, identificarea dintre masa uriașă de proteine ​​a celor care ar putea avea semnificație clinică este o sarcină extrem de dificilă. În acest sens, în studiile pe animale, se folosește adesea perfuzia de inimi izolate cu soluții de substituție a sângelui, urmată de studiul proteinelor eliberate de țesuturi în soluție. O altă direcție este studiul lichidului pericardic. Astfel, la pacienții supuși unei intervenții chirurgicale cardiace, a fost examinat nivelul proteinei H-FABP (proteina de legare a acidului gras de tip inimă) din lichidul pericardic. S-a constatat că nivelul acestei proteine ​​din lichidul pericardic, care este absent din plasma sanguină, crește în timpul ischemiei.

Proteomica bolilor pulmonare

Atunci când se studiază bolile pulmonare, din punct de vedere al proteomiei, țesutul pulmonar, lichidul care căptușește epiteliul, alveolocitele și plasma sanguină sunt folosite ca probe.

Pentru a studia proteomul fluidului care căptușește epiteliul, lichidul bronhoalveolar este folosit ca probă. Unele proteine ​​specifice țesutului pulmonar, cum ar fi glutation-transferaza și proteina B surfactant, sunt semnificativ mai abundente în acest fluid decât în ​​plasmă. Modificările lichidului bronhoalveolar sunt studiate în diferite boli: sarcoidoză, fibroză chistică, mezoteliom, alveolită fibrozoasă idiopatică etc. Studiul lichidului bronhoalveolar face posibilă și izolarea macrofagelor alveolare pentru evaluarea ulterioară a profilului lor proteomic.

Pentru a obține probe de țesut pulmonar este necesară utilizarea tehnologiilor invazive. Aceste studii au ca scop în principal evaluarea modificărilor proteomului în cancerul pulmonar. Într-un studiu realizat de D.P. Carbone a descoperit că conținutul de proteine ​​din SUMO-2 (proteina 2 asemănătoare ubiquitinei mici), timozin-p4 și ubiquitina se corelează cu prognosticul cancerului pulmonar cu celule non-mici. Au fost efectuate studii pentru a identifica modelele proteice care disting tumorile invazive de epiteliul bronșic normal. Pentru a crește fiabilitatea rezultatelor, la obținerea probelor a fost utilizată microdisecția cu laser pentru a preveni captarea țesutului sănătos. Cu toate acestea, vor fi necesare studii clinice pe termen lung înainte ca noi biomarkeri să poată fi introduși în practica clinică.

Pentru a construi profiluri proteomice ale adenocarcinoamelor, sunt utilizate și studiile cu plasmă sanguină. Astfel, atunci când au fost marcate cu oxigen radioactiv, au fost găsite 211 proteine ​​ale căror niveluri au crescut în adenocarcinomul pulmonar la șoareci și 246 proteine ​​ale căror niveluri au scăzut.

Oncoproteomica

Principalele obiective ale oncoproteomicei sunt:

Construirea proteomilor și analiza dinamicii acestora în timpul apariției și dezvoltării diferitelor tumori;

Identificarea căilor de semnalizare celulară care conduc la tumorigeneză;

Identificarea markerilor pentru diagnosticul cancerului și pentru monitorizarea răspunsului tumorii și organismului la intervenții chirurgicale și la diferite tipuri de terapie;

Determinarea răspunsului imun la tumorigeneză. Markerii tumorali sunt macromolecule (de obicei proteine

cu o componentă lipidă sau carbohidrată), a căror prezență și concentrații în plasma sanguină și/sau alt fluid biologic se corelează într-o anumită măsură cu prezența și creșterea unei tumori maligne. Printre marea varietate de indicatori utilizați în diagnosticul tumorilor, există atât markeri tumorali specifici, cât și unele substanțe, a căror concentrație se poate modifica în timpul diferitelor procese patologice, inclusiv. si tumora. Cei mai specifici markeri tumorali, practic absenți într-un organism sănătos, includ antigenele embrionare (a căror sinteză se oprește în stadiile incipiente ale dezvoltării embrionare și este deprimată în timpul transformării maligne): antigenul embrionar al cancerului, a-fetoproteina. Antigenele tumorale specifice sunt molecule (produse secretoare sau glicoproteine ​​membranare) exprimate mai intens de celulele tumorale decât de celulele normale. Acestea includ CA 19-9, CA 15-3 (glicoproteine ​​de membrană), precum și antigenul specific prostatic (PSA), un produs secretor al glandulocitelor de prostată. In plus, hormonii (gonadotropina corionica umana) si substantele din alte grupe (tiroglobulina, P2-microglobulina etc.) pot actiona ca markeri tumorali. Pentru a prezice evoluția bolii, sunt examinate proteinele care sunt markeri ai activității proliferative și proteinele care reglează apoptoza (Fig. 1).

Domeniile de aplicare clinică a markerilor tumorali sunt următoarele:

Diagnosticul precoce al cancerului;

Monitorizarea și evaluarea eficacității tratamentului;

Definiţia forecast.

Pe baza celor de mai sus, principalele cerințe pentru un marker tumoral sunt sensibilitatea și specificitatea suficient de ridicate, corelarea cu volumul tumorii și capacitatea de a furniza informații despre localizarea tumorii.

Sensibilitatea și specificitatea majorității biomarkerilor tumorali disponibili în prezent sunt adesea insuficiente. Markerii pentru care sensibilitatea la o specificitate de 95% este mai mare de 50% sunt considerați utili din punct de vedere clinic și doar câțiva dintre ei pot demonstra o sensibilitate de peste 70% la un anumit nivel de specificitate. Există 2 abordări ale căutării de noi markeri tumorali: prima presupune cercetarea direcționată bazată pe cunoștințele moderne despre carcinogeneză, testarea anumitor ipoteze; a doua este o căutare empirică prin compararea proteomilor celulelor normale și tumorale sau prin compararea profilului proteic al serurilor pacienților sănătoși și bolnavi; cu și fără factori de risc.

Să luăm în considerare posibilitățile de utilizare a markerilor tumorali moderni în cele 3 aspecte menționate mai sus.

1. Diagnosticare. Din cauza lipsei de sensibilitate, majoritatea markerilor tumorali sunt nepotriviți pentru studiile de screening în populația generală. Cu toate acestea, unele dintre ele pot fi utilizate eficient pentru diagnosticarea precoce în grupurile de risc în care probabilitatea bolii este inițial mai mare. Deci, screening PSA

COMUNICAȚII ȘTIINȚIFICE

Analiza expresiei genelor

Proteină

microcipuri

Spectrometrie de masa

Automatizat

profile IHC

A____________

Evaluarea prognosticului Alegerea unei metode de tratament Obținerea de noi anticorpi

Tehnici imunohistochimice (IHC).

Ser

Metode indirecte

Monitorizarea tratamentului

L_________

Selectarea metodei de tratament Monitorizarea eficacității tratamentului identificarea efecte secundare

Bază de date

Metode directe

Diagnosticare

LA___________

Diagnosticul precoce în grupurile de risc Diagnosticul recăderilor

Orez. Tehnologii proteomice în diagnosticul cancerului.

efectuat la un grup de bărbați cu vârsta peste 50 de ani; screening pentru a-fetoproteina (un marker al carcinomului hepatocelular) - la pacienții cu ciroză hepatică; pentru calcitonina (un marker al cancerului medular tiroidian) - la persoanele cu antecedente familiale.

2. Monitorizarea evoluției bolii. În prezent, markerii tumorali sunt cei mai folosiți în aceste scopuri. Un semn al unei intervenții chirurgicale radicale de succes este o scădere persistentă a concentrației markerului. Creșterea sa ulterioară indică, în funcție de timpul și viteza de creștere, prezența unei tumori reziduale, apariția unei recidive sau a metastazei izolate.

3. Predicția evoluției bolii și determinarea tacticilor de tratament. Nivelul multor markeri tumorali se corelează cu volumul tumorii primare și crește brusc cu metastazele locale și la distanță. Deci, de exemplu, în leucemia limfocitară cronică, conținutul markerului seric de deoxitimidină sintetază se corelează cu evoluția bolii (stabil sau progresiv).

Pentru a prezice evoluția bolii, se determină și expresia markerilor activității proliferative: proteina Ki-67, PCNA, cicline (de exemplu, ciclina D1), inhibitori ai kinazelor dependente de ciclină. Nivelurile proteinelor care reglează apoptoza (Bcl-2, Bcl-x, Bax, Bak etc.) sunt de mare importanță prognostică. Recent, inhibitorii apoptozei - servivina și telomeraza - au fost studiați intens. Concentrații crescute ale acestor molecule au fost demonstrate în tumorile din multe, deși nu toate, locațiile. Mai mult, nivelul lor de expresie se corelează cu stadiul dezvoltării tumorii. Pentru unele tipuri de carcinoame, a fost dovedită o corelație a cursului cu nivelul de exprimare a proteinei p53, precum și cu numărul de forme mutante ale acestei proteine.

Tipul de marker studiat și semnificația rezultatului variază în funcție de structura histologică și localizarea tumorii. Concluzia finală se face după o evaluare cuprinzătoare cu alți factori. O sarcină importantă în oncologie este identificarea căilor de semnalizare implicate în procesul de carcinogeneză. Rolul proteinelor reglatoare a apoptozei în acest proces este indubitabil: p53, proteine ​​din familia bcr etc. Accentul proteomicii funcționale este studiul interatomilor acestor proteine, cu alte cuvinte, reconstrucția interacțiunilor moleculare în care sunt implicate aceste proteine.

Problema principală în introducerea oncoproteomicii în practică este dificultatea de a pregăti oncologii să citească hărțile oncotranscriptomului și oncoproteomului.

Tipuri de molecule proteice și caracteristici ale interactomilor

Deși multe proteine ​​își îndeplinesc funcțiile în mod independent, marea majoritate a acestora necesită interacțiuni foarte specifice cu alte proteine ​​din organism pentru a-și manifesta activitatea biologică. Exemple de diferite interacțiuni proteină-proteină găsite în sisteme biologice complexe:

Interatomi proteină-proteină în compartimente celulare strict definite;

Proteine ​​mesager care interacționează cu receptorii de pe suprafața exterioară a membranei celulare, care este o condiție necesară pentru declanșarea cascadelor de semnalizare;

Proteine ​​care formează rețea și interacțiuni structurale, relații structurale la nivel intercelular;

Inhibitori de enzime;

BULETINUL RAMS /2013/ Nr 1

Modificare (deseori urmată de denaturare) datorită acțiunii enzimelor;

Interacțiuni ale subunităților proteice care conduc la efecte alosterice în compoziția biocomplexelor multimerice;

Interacțiuni proteină-proteină care stau la baza funcțiilor motorii ale organelor individuale, ale organelor sau ale corpului în ansamblu (contracție musculară). Interacțiunile proteice sunt de obicei împărțite în

în stabil și tranzitoriu, iar ambele tipuri pot fi furnizate atât de legături intermoleculare puternice, cât și de cele slabe.

Interacțiunea stabilă este observată în proteinele formate din mai multe subunități-complexe și lanțuri polipeptidice. Exemple tipice de molecule de proteine ​​complexe constând din mai multe lanțuri polipeptidice legate stabil sunt hemoglobina și polimerazele.

Interacțiunile tranzitorii proteină-proteină sunt implicate în controlul majorității proceselor de semnalizare intra și extracelulară. Interacțiunile tranzitorii necesită de obicei un set specific de condiții care promovează dezvoltarea diferitelor efecte fiziologice, și anume fosforilarea, modificări conformaționale sau localizarea într-o regiune discretă a celulei. Proteinele care interacționează tranzitorii sunt implicate într-o gamă largă de procese celulare, inclusiv în modificarea proteinelor catalitice, transport, rezervă, semnalizare, reglare, receptor și funcții motorii.

Interacțiunea tranzitorie proteină-proteină se observă și în timpul transportului proteinelor prin porii membranei, în timpul deformării proteinelor native, în anumite etape ale ciclului de translație și reformarea structurilor celulare în timpul ciclului celular (microfilamente citoplasmatice, complex de pori nucleari, etc.).

Proteinele se pot lega între ele prin legături hidrofobe/hidrofile, forțe van der Waals și punți ionice între domeniile de legare de pe fiecare proteină. Aceste domenii pot fi reprezentate de o zonă mică a suprafeței proteinei și constau doar din câteva peptide. Pe de altă parte, proteinele cu regiuni polipeptidice lungi care se întind pe sute de aminoacizi sunt răspândite; puterea legării lor depinde de mărimea și proprietățile domeniului de legare. Una dintre cele mai comune legături intraproteice care oferă stabilitate întregii molecule este fermoarul de leucină.

În fermoarul cu leucină, aminoacidul leucina se găsește la aproximativ fiecare a 8-a poziție a α-helixului, rezultând reziduuri de leucină pe o parte, formând o spirală amfipatică în care o parte este hidrofobă. Astfel, fermoarul cu leucină formează o proteină dimerică prin legarea a două elice α paralele împreună ca un fermoar.

Cele două domenii omoloage Src (SH), SH2 și SH3, sunt un exemplu de domenii de legare tranzitorii care sunt conectate prin secvențe peptidice scurte și se găsesc în mod obișnuit în proteinele de semnalizare. Domeniul Sffi „recunoaște” numai secvențe de peptide cu resturi de tirozină fosforilate, ceea ce este un semn al unei proteine ​​activate. Cu alte cuvinte, regiunea SH2 este cea mai importantă regiune de pe receptorul implicat în calea de semnalizare a factorului de creștere, în care aceste reziduuri sunt recunoscute prin fosforilarea mediată de receptor de ligand a resturilor de tirozină de către domeniile Sffi. Domeniile SH3 recunosc în mod obișnuit secvențele peptidice bogate în prolină și se găsesc în mod obișnuit în enzime cum ar fi kinaze, fosfolipaze și GTPaze. Ele sunt concepute pentru a identifica proteinele țintă.

Concluzie

Proteomica, fiind o știință fundamentală, este totuși indispensabilă în rezolvarea unui număr de probleme practice medicale și științifice aplicate. Studiul diferitelor fluide biologice ale corpului folosind tehnici tehnologice moderne de proteomică poate oferi diagnosticianului cantități suficiente de informații necesare pentru un diagnostic fără ambiguitate sau evaluarea riscurilor unei anumite boli la un anumit pacient. Construirea de algoritmi pentru monitorizarea preclinica si clinica a pacientilor folosind un conglomerat de proceduri de diagnostic de laborator, inclusiv metode de analiza genomice, transcriptomice si proteomice, precum si tehnici bioinformationale pentru prelucrarea si analiza datelor, este cheia pentru identificarea cu succes a unui patologic. starea latentă, verificarea diagnosticului, definirea și posibila predicție a tipului și naturii evoluției bolii, precum și monitorizarea reacțiilor corpului pacientului ca răspuns la tipul de terapie utilizat.

LITERATURĂ

1. Alaoui-Jamali M.A., Xu Y.J. Tehnologia proteomică pentru profilarea biomarkerilor în cancer: o actualizare. J. Zhejiang. Univ. Sci. B. 2006; 6: 411-420.

2. Introducere în diagnosticul molecular. Ed. DOMNIȘOARĂ. Paltseva. M.: Medicină. 2010. 368 p.

3. Anderson N.L., Anderson N.G. Proteomul plasmatic uman: istorie, caracter și perspective de diagnostic. Mol. Proteomica celulară. 2002; 11: 845-867.

4. Sturgeon C. Perspective în conferința de proteomică clinică: translating clinical proteomics into clinical practice. Exp. Rev. Proteomica. 2010; 4: 469-471.

5. McGregor E., Dunn M.J. Proteomica bolilor de inima. Zumzet. Mol. Genet. 2003; 2: 135-144.

6. Edwards A.V., White M.Y., Cordwell S.J. Rolul pro-teomics în descoperirea clinică a biomarkerilor cardiovasculari. Mol. Celul Pro-teomics. 2008; 10: 1824-1837.

7. Bowler R.P., Ellison M.C., Reisdorph N. Proteomics in pulmonary medicine. Cufăr. 2006; 2: 567-574.

Deci, sarcina principală a proteomicii este de a identifica mecanismul de interacțiune a unui număr mare de proteine ​​și peptide într-un singur organism. Care este semnificația practică a acestei lucrări grandioase și costisitoare? Este evident că farmacologii și medicii sunt interesați în primul rând de rezultatele unei astfel de lucrări, deoarece foarte adesea există o legătură strânsă între modificările compoziției proteinelor și starea de boală a unei persoane. Prin urmare, noi date din proteomică vor fi (și sunt deja utilizate) pentru dezvoltarea rapidă a unor noi medicamente și noi tratamente pentru bolile cu care medicina se luptă de secole. Astăzi, 95% din toți agenții farmacologici afectează proteinele. Proteomica, cu abordarea sa de sisteme, poate ajuta la identificarea și evaluarea importanței proteinelor emergente mult mai eficient, ceea ce, la rândul său, va accelera dezvoltarea de noi teste de diagnostic și terapii.

Prima aplicare practică a cercetării proteomice a avut loc cu mult înainte de apariția termenului de „proteomică”, la începutul secolului al XX-lea, când a fost descoperit rolul insulinei în dezvoltarea unei boli atât de grave precum diabetul. Crearea medicamentelor cu insulină a salvat viețile a milioane de oameni.

În prezent, proteomica, împreună cu genomica și bioinformatica, se concentrează pe crearea de noi medicamente (Fig. 18), în care anumite proteine ​​vor servi ca ținte moleculare. Procesul de găsire a unor noi ținte de medicamente este rezolvat folosind bioinformatica, iar obiectul analizei este gena. Cu toate acestea, după analizarea genomului, este necesar să se obțină dovezi că această proteină este intens exprimată și este în stare de funcționare în celulă. Proteomica rezolvă această problemă. În acest fel, se identifică ținta genetică moleculară pentru medicament.

Trebuie remarcat faptul că proteomica în sine poate rezolva problema găsirii unei ținte. Dacă obținem hărți proteomice (asemănătoare cu cele prezentate în Fig. 3 sau 4) ale țesuturilor normale și patologice, atunci din diferențele dintre acestea putem determina care proteine ​​sunt importante pentru dezvoltarea unei anumite stări patologice și le selectăm ca ținte. sau utilizați aceste cunoștințe pentru diagnostic. Se poate presupune că în viitor crearea de hărți proteomice de sânge va fi adăugată la testele de sânge de rutină. Pentru a face acest lucru, clinicile vor trebui să utilizeze echipamente speciale cu care se va preleva periodic sânge de la pacienți. Dacă apare o stare de boală, harta proteomică a unei persoane bolnave va trebui doar comparată cu propria sa hartă proteomică, dar compilată într-un moment în care era sănătos și va fi posibilă identificarea modificărilor în compoziția proteinelor din sânge. și determină cauza bolii. O astfel de comparație între proteoamele tumorii și celulele normale, celulele înainte și după expunerea la anumiți factori (de exemplu, fizice sau chimice), utilizarea fluidelor biologice în scopuri de diagnosticare - toate acestea sunt de mare interes și deschid perspective complet noi pentru medicină, medicină veterinară, farmacologie, industria alimentară și alte domenii de aplicare. Urmează o muncă enormă și interesantă.

Bibliografie

1.Sanger F., Air G.M., Barrell B.G., Brown N.L. et al. Secvența de nucleotide a bacteriofagului phi X-174 ADN.//Nature. 1977. V. 265, Nr. 5596. P. 687–695.

2.Fleischmann R.D., Adams M.D., White O. et al. Secvențierea aleatorie a întregului genom și asamblarea Haemophilus influenzae Rd.//Science. 1995. V. 269, nr. 5223. P. 496–512.

3.Natura. 2001. 409, No. 6822 (majoritatea numărului revistei este dedicată descifrării genomului uman).

4.Ferguson-Smith A.C., Ruddle F.H. Genomica locilor care conțin homeobox uman.//Pathol. Imunopatol. Res. 1988. V. 7, nr.1–2. P. 119–126.

5.Franklin J. Bioinformatica schimbând fața informației.//Ann. NY Acad. Sci. 1993. V. 700. P. 145–152.

6.Wasinger V.C., Cordwell S.J., Cerpa-Poljak A. et al. Progrese cu cartografierea genelor-produsului molicutelor: Mycoplasma genitalium.//Electroforeza. 1995. V. 16, Nr. 7. P. 1090–1094.

7. Zamyatnin A.A. Lumea strălucitoare a proteinelor și peptidelor.//Biologie. 2002. Nr. 25–26. P. 8–13.

8.Gorg A., Weiss W., Dunn M.J. Tehnologia actuală de electroforeză bidimensională pentru proteomică.//Proteomics. 2004. V. 4, Nr. 12. P. 3665–3685.

9.Ramstrom M., Bergquist J. Miniaturizată proteomică și peptidomică folosind separarea lichidelor capilare și spectrometria de masă de înaltă rezoluție.//FEBS Lett. 2004. V. 567, nr. 1. P. 92–95.

10. http://au.expasy.org/sprot/

11 http://erop.inbi.ras.ru/

12. Malygin A.G. Metabolismul acizilor carboxilici (schema periodică). – M.: „Programul Internațional de Educație”, 1999.

13. Archakov A.I. Ce este genomica? – Proteomică.//Issue. Miere. chimie. 2000. T. 46, nr. 4. p. 335–343.

14. ru.wikipedia.org/wiki/Proteomics

15. www.biomed.spbu.ru/equipment/proteomics/

16. thesaurus.rusnano.com/wiki/article1579

17. www.inbi.ras.ru/ubkh/49/Terentiev.pdf

18. www.strf.ru/material.aspx?CatalogId=352&d_no=11979

19. www.textronica.com/lcline/proteomics/proteomics.html

20. www.bionet.nsc.ru/bioinf/files/proneomika.pdf

21. www.bionet.nsc.ru/bioinf/files/proneomika.pdf

Un biolog domestic, în special un biolog molecular, trebuie să scrie din ce în ce mai rar limba maternă. Este clar că majoritatea articolelor științifice din domeniul nostru sunt scrise în limba actuală de comunicare științifică - engleza. Prin urmare, în loc de o introducere, vreau să mulțumesc redactorului-șef al Biomolecules - el a putut cumva să mă forțeze să scriu acest text, trezind fie o mâncărime grafomanică, fie un ego inflamat, fie pur și simplu o dragoste pentru rus. limba. Dar mi-a fost ușor să scriu: prin voința sorții, fac același lucru de mai bine de cincisprezece ani - identificarea și analiza cantitativă a proteinelor. Adică ceea ce se numește astăzi proteomica. Aproape tot ce știu despre asta este, dacă este posibil, prezentat în rândurile următoare.

Partenerul general al ciclului este compania: cel mai mare furnizor de echipamente, reactivi și consumabile pentru cercetare și producție biologică.

Una dintre misiunile principale ale Biomolecule este de a ajunge la rădăcini. Nu vă spunem doar ce fapte noi au descoperit cercetătorii - vorbim despre cum le-au descoperit, încercăm să explicăm principiile tehnicilor biologice. Cum să scoți o genă dintr-un organism și să o introduci în altul? Cum poți urmări soarta mai multor molecule minuscule dintr-o celulă imensă? Cum să excitați un grup mic de neuroni dintr-un creier imens?

Și așa am decis să vorbim mai sistematic despre metodele de laborator, să reunim într-o singură secțiune cele mai importante, mai moderne tehnici biologice. Pentru a o face mai interesantă și mai clară, am ilustrat intens articolele și chiar am adăugat animație ici și colo. Ne dorim ca articolele din noua secțiune să fie interesante și de înțeles chiar și pentru un trecător ocazional. Și, pe de altă parte, ar trebui să fie atât de detaliate încât chiar și un profesionist ar putea descoperi ceva nou în ele. Am colectat metodele în 12 grupuri mari și urmează să facem un calendar biometodologic pe baza acestora. Rămâneți pe fază pentru actualizări!

Eram fericit, nu aveam suficiente zile și viața mea era plină de sens.
Frații Strugatsky. Luni incepe sambata
— Zece ani, spuse el râzând, mestecând. - Îi va lua atât de mult să scrie ceva.
James Joyce. Ulise (tradus din engleză de V. Hinkis și S. Khoruzhy)

Partea 1. Înainte de genom. Puteți identifica doar ceea ce înțelegeți natura.

Fizicienii glumesc: „ Totul va merge bine în afacerea ta când biologia devine chimie, iar chimia devine fizică" Istoria proteomicii înainte de a ei starea curentaÎmi amintește puțin de această glumă. Fizicienii au creat o tehnologie puternică, iar când științele vieții au devenit o tendință la modă, au încercat să o folosească pentru a analiza proteinele. Inițial, dezvoltarea instrumentelor fizice a stimulat utilizarea lor în biologie și medicină, iar rezultatele – demonstrații – nu au făcut decât să lase aluzie la unele realizări reale. Acum este momentul în care se văd rezultate serioase în acest domeniu, inclusiv pentru medicină. Voi încerca aici să vorbesc despre dezvoltarea analizei proteinelor de mare performanță - proteomica - pe care o observ de mult timp și o observ prin ochii unui biolog. Poate că fizicienii vor glumi din nou, dar le va fi puțin mai ușor pentru colegii biologi și medici să înțeleagă esența a ceea ce se întâmplă.

Figura 1. Etape proteomice majore. 1950- Grupul suedez Per Edman a propus o metodă chimică pentru secvențierea peptidelor. 1951–1955- Sub conducerea britanicului Frederick Sanger, au determinat structura proteinei scurte de insulină și au demonstrat că proteinele individuale nu sunt amorfe din punct de vedere al compoziției, ci au o secvență constantă de reziduuri de aminoacizi. 1959- Americanii Rosalyn Yalow și Solomon Berson au creat primul imunotest, inclusiv pentru determinarea proteinelor. 1967- Am creat primul secvențior automat de proteine ​​folosind metoda Edman. 1970- Elvețianul Ulrich Laemmli a propus metoda optimă de electroforeză pe gel a proteinelor în condiții de denaturare - folosind dodecil sulfat de sodiu. 1975- Americanul Patrick O'Farrell și germanul Joachim Klose au inventat independent electroforeza proteinelor 2D și au obținut primele hărți proteomice. 1984- Sub conducerea americanului John Fenn, au dezvoltat ionizarea moleculelor prin electrospray. Ulterior, a făcut posibilă efectuarea spectrometriei de masă a macromoleculelor, inclusiv a proteinelor, fără distrugerea acestora. 1985- Koichi Tanaka din Japonia a propus ionizarea moale a macromoleculelor cu un laser pentru spectrometria de masă. Germanii Franz Gyllenkamp și Michael Karas au folosit o metodă similară pentru proteine ​​și peptide. A apărut metoda de ionizare MALDI. 1993-1996- Mai multe grupuri de cercetători au propus identificarea proteinelor folosind spectrometria de masă a fragmentelor de proteoliză și căutarea secvențelor prezise din genom. A apărut o hartă peptidică spectrometrică de masă (amprentă peptidică sau amprentă). 1994- Termenul „proteom” ca adaos de proteine ​​la genom a fost introdus de studentul absolvent australian Mark Wilkins. 1994–1999- Au aparut primele programe de cautare pentru identificarea proteinelor folosind spectrometria de masa folosind secvente genomice. Proteomica a devenit disponibilă pentru o gamă largă de utilizatori. 1999–2001- Foc rapid ( pușcă) proteomica. Mai multe grupuri de cercetare au propus combinarea cromatografiei lichide de înaltă performanță și spectrometriei de masă în tandem pentru a identifica amestecurile de peptide. S-a folosit ionizare prin electrospray. 2000–2005- Fizicianul rus Alexander Makarov, care lucrează în străinătate, a inventat un nou tip de capcană de ioni - Orbitrap. Pe dispozitive Orbitrap punere în funcțiune. Spectrometria de masă de înaltă rezoluție s-a democratizat și a început să fie utilizată pe scară largă în proteomică. 2005- Americanii Christy Hunter și Lee Anderson au demonstrat utilizarea unei metode spectrometrice de masă pentru monitorizarea reacțiilor multiple ( MRM) pentru analiza cantitativă a peptidelor naturale. Proteomica dirijată (țintită) a apărut. 2007- Sub conducerea americanului Stephen Gigi au propus noua metoda evaluarea ratei rezultatelor fals pozitive din proteomica cu foc rapid folosind secvențe „false” (analiza ). 2012–2014- Proteomica cu foc rapid a atins nivelul de identificare a aproximativ 10 mii de proteine ​​umane într-o probă - aproximativ jumătate din cele codificate în genom. Sub conducerea germanului Bernhard Kuster și a americanului Akhilesh Pandey, au fost publicate în mod independent lucrări care declară versiuni preliminare ale proteomului uman complet.

Să trecem la o perioadă în care procesele matriceale de transfer de informații în celulă erau deja studiate în linii mari (Fig. 1). Era clar cum in vivo proteinele sunt sintetizate și din ce aminoacizi constau. În același timp, la începutul anilor 1980, se dezvoltase deja imunologia moleculară și o tehnică pentru obținerea Anticorpi monoclonali. Au început să se dezvolte metode de producere a proteinelor recombinante, alimentate de invenție reacția în lanț a polimerazei. Metodele de separare a biomoleculelor au ajuns la perfecțiune - diferite tipuri cromatografiaȘi electroforeză .

Activitatea enzimatică - primele cunoștințe despre proteine

Pentru a stabili sarcina „identificării” unei proteine ​​într-o probă biologică, era deja necesar să se recunoască existența „dogma” criciană a biologiei moleculare, în care codul acidului nucleic este convertit, cu pierderi de informații, într-un aminoacid. secvenţă. Identificarea unui compus este stabilirea structurii sale; în cazul unei polipeptide, o determinare completă sau parțială a secvenței sale, cu alte cuvinte, secvențiere. Următoarea etapă va fi nu numai identificarea (adică analiza calitativă a proteinei), ci și determinarea concentrației acesteia - analiza cantitativă. În mod interesant, conceptul de determinare a activității unei proteine ​​s-a dezvoltat chiar înainte de stabilirea naturii sale chimice. Aproximativ, activitatea enzimatică a cărnii tocate proaspete (adică mușchiul omogenizat de mamifer) a putut fi stabilită prin metode spectrofotometrice simple încă de la începutul secolului al XX-lea (Fig. 2), când baza chimică a vieții rămânea necunoscută. Cu toate acestea, catalizatorul proteic care realizează această reacție ar putea fi cuantificat în unități arbitrare de activitate. Și încă în clinică, mulți biomarkeri sunt determinați în astfel de unități convenționale - de exemplu, alanina aminotransferazaȘi aspartat aminotransferaza, în ciuda faptului că tehnologia modernă este capabilă să determine cantitatea lor absolută. În cazul multor enzime, activitatea de determinare este atât convenabilă, cât și corectă, deoarece unele molecule pot să nu funcționeze din cauza inactivării, în timp ce sunt prezente în probe.

Acestea sunt enzime intracelulare care organizează metabolismul carbohidraților și aminoacizilor din mitocondriile celulare. Apariția lor în sânge indică distrugerea celulelor hepatice.

Anticorp ca identificator împotriva opusului

Pe lângă evaluarea activității, din anii 1970 cercetătorii au mai avut o oportunitate de a cuantifica proteinele fără a le cunoaște structura. Este despre despre utilizarea anticorpilor, în special monoclonal, a cărei producție a fost inventată în 1975; Articolul " 12 metode în imagini: tehnologii imunologice". Anticorpii pot fi produși împotriva componentelor purificate sau împotriva țesuturilor, celulelor sau fracțiunilor întregi. Mai mult, dacă sunt monoclonale, atunci sistemul de producție și caracteristicile lor analitice rămân neschimbate de la un lot la altul. Dacă știm împotriva ce au fost anticorpii, adică am folosit un antigen purificat și identificat printr-o altă metodă, „ortogonală”, atunci substanța de legare rezultată - anticorpul - poate fi utilizată pe scară largă pentru reidentificarea lui în amestecuri complexe. Este mai interesant cu anticorpii obținuți la antigene necunoscute. Neavând idee despre structura antigenului, astfel de anticorpi au început să fie utilizați pentru a diagnostica tumorile maligne. Unii dintre ei și-au legat mult mai mult antigenul de oameni bolnavi decât de oameni sănătoși. Metodologia de evaluare a fost standardizată și astfel de anticorpi monoclonali au început să fie utilizați pentru diagnostic, fără a se cunoaște exact structura chimică a antigenului. Un exemplu izbitor al acestei abordări este glicoproteina CA-125, descoperită de Robert Bast și co-autori sub forma unui anticorp la aceasta încă din 1981. Abia mult mai târziu a fost identificată gena acestui produs și proteina în sine - mucină 16.

Izolarea proteinelor pure și secvențierea Edman

Cu toate acestea, până în anii 1970, biochimiștii nu mai erau mulțumiți să lucreze orbește, cum ar fi măsurarea activității enzimelor și a altor compuși fără a înțelege structura lor chimică. Au apărut metode de purificare a proteinelor care au combinat principiile cromatografiei, electroforezei și centrifugării, dintre care unele au dispărut de la utilizare, în timp ce altele sunt încă în uz. O sarcină separată a fost confirmarea purității compușilor din fracții după purificare. În acest scop s-au folosit metode spectrale (de la simplu la complex), precum și vizualizarea benzilor colorate în timpul electroforezei. Obținerea dintr-un biomaterial a unei proteine ​​izolate până la o puritate de cel puțin 90% fără utilizarea de anticorpi și alți lianți specifici, atât atunci, cât și acum, este un proces lung, care necesită multă muncă. Anii 1970-1980 au fost epoca de aur a dezvoltării metodelor de separare a proteinelor, când au fost turnate geluri uriașe de electroforeză și au fost construite coloane lungi de un metru pentru cromatografia manuală și automată.

Dacă ai noroc, atunci după câteva luni sau ani de muncă minuțioasă ești convins că într-o eprubetă sau într-un gel se află „produsul” tău - proteina a cărei funcție o studiezi. Ce opțiuni aveți pentru a-l identifica dacă sunteți încă în secolul al XX-lea? În primul rând, dacă aveți o ipoteză despre dacă Ce în eprubeta dumneavoastră, puteți utiliza anticorpi cunoscuți dacă sunt disponibili comercial sau furnizați cu amabilitate de către proprietari. Desigur, dacă anticorpii sunt disponibili astăzi tipuri diferite la majoritatea proteinelor umane și animale model, dar la acea vreme gama lor era mult mai modestă. Prin urmare, șansa de colorare a moleculei de interes cu anticorpi este foarte mică. Dar nu dispera! În anii 1950, chimistul suedez Per Edman a dezvoltat o metodă de secvențiere a peptidelor (Fig. 3).

Figura 3. Secvențierea Edman a proteinelor. Dacă procesezi peptida izotiocianat de fenil (FITC), atomul de carbon electrofil de pe radicalul izotiocianat, cu alcalinizare moderată, interacționează cu azotul nucleofil al grupării amino neîncărcate. Ca rezultat, se formează un radical feniltiocarbamoil la capătul N-terminal al peptidei. Dacă amestecul de reacție este acidificat moderat, acesta este scindat, luând cu el aminoacidul N-terminal, pentru a forma tiazolinonă cu un radical specific care caracterizează acest aminoacid. Cu toate acestea, restul lanțului de aminoacizi rămâne neschimbat. Derivatul special, care va diferi prin radicalul aminoacid inerent, este din nou convertit în condiții acide - pentru stabilizare - și analizat cromatografic. În acest fel este posibil să se distingă astfel de derivați pentru toți aminoacizii, deoarece datorită radicalului caracteristic ei vor fi caracterizați prin timpul lor de ieșire din faza inversă. Dacă proteina sau peptida pe care o analizăm este atașată la un suport în fază solidă, derivatul de aminoacid N-terminal poate fi spălat și analizat separat și ciclul de analiză repetat, formând astfel secvența de aminoacizi.

Metoda lui Edman era foarte progresivă la acea vreme. A furnizat secvențe de până la 30 de reziduuri de aminoacizi cu o precizie ridicată. S-a caracterizat printr-o sensibilitate destul de mare, fiind capabilă să secvențeze peptidele în cantități mai mici de 0,1 nmol cu ​​o precizie de 99%. Mai mult decât atât, la sfârșitul anilor 1960 a fost automatizat sub forma unui secvențior de peptide, în care un excavator robot a îndepărtat alternativ derivații N-terminali din polipeptidele montate pe hârtie specială, trimițându-i apoi la cromatograf. Dar cercetătorii au dorit din nou mai mult - nu au fost mulțumiți de necesitatea de a purifica peptidele și proteinele înainte de secvențiere, precum și de alte limitări ale metodei Edman, în special, incapacitatea acesteia de a secvenționa produsele cu un N-terminal modificat.

Încă există puțin interes pentru metoda lui Edman, în special pentru proteinele și peptidele acelor organisme a căror secvență nu poate fi prezisă din datele de secvențiere a acidului nucleic. Această metodă implementează analiza directă, unde erorile sunt asociate cu erorile tehnice. Metodele de analiză a secvențelor de aminoacizi care au urmat conțin elemente de predicție, astfel încât erorilor algoritmice se adaugă erorilor tehnice (vezi mai jos).

Electroforeza bidimensională - prima hartă a proteomului

După cum am menționat mai sus, în pregătirea pentru analiza calitativă și cantitativă a proteinelor, au fost utilizate metode convenționale de separare moleculară, inclusiv electroforeza. În 1970, a avut loc o revoluție metodologică în electroforeza proteinelor - elvețianul Ulrich Laemmli a propus metoda optimă de electroforeză pe gel în condiții de denaturare. Proteinele au fost sever denaturate cu o substanță amfifilă, cum ar fi săpunul - dodecil sulfat de sodiu, - datorită căruia fiecare moleculă a fost acoperită cu un strat din acest detergent. Sarcina negativă totală a unui astfel de complex s-a dovedit a fi aproximativ proporțională cu greutatea moleculară a proteinei. Acest lucru a făcut posibilă separarea proteinelor într-un gel de poliacrilamidă, deși folosind un câmp electric, dar în funcție de greutatea moleculară. Pentru a fi corect, observăm că Laemmli nu a inventat metoda de novo, ci doar l-a optimizat conform premiselor existente în literatura de specialitate. Pentru aceasta, apropo, munca sa este acum unul dintre cele mai citate cinci articole științifice din lume. Evoluții în acest domeniu au fost publicate mai devreme, inclusiv în 1967 de americanul Arnold Shapiro și de coautori.

Metoda Laemmli bine acceptată a început să fie îmbunătățită și combinată cu alte tipuri de separare a proteinelor. În 1975, americanul Patrick O'Farrell și germanul Joachim Klose au propus în mod independent combinarea electroforezei pe gel denaturant cu electrofocalizarea preliminară a proteinelor. Focalizarea se realizează într-un tub de sticlă relativ subțire, gros ca gel (1–2 mm). Tubul este umplut cu un gel cu polimeri speciali - amfoline , - care sunt capabile să creeze un gradient de pH staționar în el. Astfel, la mutare câmp electric proteinele depuse în acest tub se opresc în zona în care amfolinele au atins un pH egal cu punct izoelectric molecule proteice. Gelul sub formă de fir subțire este stors din tub și fuzionat pe placa de gel finită pentru foreza de denaturare convențională Laemmli, după care separarea este efectuată în cealaltă direcție. Proteinele, distribuite inițial la punctul izoelectric, se mișcă acum în funcție de greutatea lor moleculară. Metoda rezultată este numită pe bună dreptate bidimensionale (2D ) electroforeză (Fig. 4). După cum v-ați putea aștepta, fiecare proteină de pe placa finală de gel după colorare nu apare ca o dungă (spre deosebire de gelul denaturant convențional), ci ca o pată rotundă, concentrată. Astfel, O'Farrell și Klose au arătat pentru prima dată o hartă a proteinelor, în care fiecare punct de pe o placă mare de gel (până la 40x40 cm) reprezintă o izoformă a proteinei, iar dimensiunea și intensitatea acesteia sunt mai mult sau mai puțin proporționale cu concentrația sa.

Mâinile iscusite ale biochimiștilor din trecut au îmbunătățit în mod repetat metoda electroforezei bidimensionale, care a condus în analiza proteinelor până la mijlocul anilor 2000. În loc să umple tuburile, amfolinele au fost așezate pe benzi gata făcute. Au fost sugerate diferite dispozitive pentru prepararea plăcilor de gel, diverse modificări ale procesului de electroforeză și pentru diferite dimensiuni și grosimi ale gelului în funcție de sarcina de cercetare. Coloranții, inclusiv cei fluorescenți, au fost îmbunătățiți în sensibilitate. Mai mult, în urma popularității gelurilor bidimensionale, unele procese de preparare și colorare a acestora au fost automatizate. Deoarece caracteristicile petelor colorate sunt indirect legate de cantitatea de proteină din probă, este atractiv să comparăm imaginile gelurilor obținute din aceleași probe în condiții diferite. Procesarea imaginilor cu gel a devenit, de asemenea, automatizată, cu multe programe de calculator concurente care au apărut pentru a procesa și compara scanările 2D cu gel.

În funcție de intervalul de concentrație al proteinelor găsite în biomaterial, numărul de pete individuale pe geluri bidimensionale a ajuns la 5 mii. Din punctul de vedere de astăzi, este evident că asta nu înseamnă că produsele a 5 mii de gene sunt vizualizate pe gel. Izoformele aceluiași produs genic care diferă în secvență datorită heterozigozității sau proteolizei sau în structură mai fină datorită modificărilor reziduurilor, vor avea tendința de a apărea ca pete distincte. De exemplu, scindarea unui reziduu de arginină din proteina amiloid-alfa mică a schimbat punctul izoelectric atât de semnificativ încât pata de pe gel sa deplasat cu aproximativ 10 cm.

Cu toate acestea, o electroferogramă bidimensională cu mii de proteine ​​vizualizate poate fi considerată o premieră proteom - adică primul tip de analiză în care se determină întregul set de proteine ​​prezente într-o probă biologică, sau o proporție semnificativă a acestora. Observ că această metodă a fost dezvoltată cu mult înainte de apariția termenului „proteom”, dar mai multe despre asta mai târziu.

Să presupunem că am analizat probe experimentale și de control prin electroforeză bidimensională, de exemplu, linii celulare după tratamentul cu un medicament și fără un astfel de tratament. Am obținut hărți similare de electroferogramă, dar zece pete au apărut după tratament, cinci au dispărut complet, iar un alt număr le-a schimbat intensitatea. Ce putem face dacă suntem în 1990? Tot ce am vorbit mai devreme. Aplicați metoda Edman. Colorați electroferograma cu anticorpii care sunt disponibili, adică efectuați Western blot. Pentru ambele opțiuni, proteinele din gel sunt transferate folosind un câmp electric pe o hârtie sau o membrană similară, din care se efectuează manipulări suplimentare. Limitările utilizării anticorpilor sunt clare - deși sunt sensibili, își văd doar țintele. Limitarea metodei lui Edman aici este sensibilitatea. Funcționează bine din zeci și sute de pmol de proteine, iar coloranții moderni „văd” pete care conțin 2,5-5 pmol. Având în vedere pierderile în timpul transferului pe membrană și necesitatea probabilă de scindare a proteinelor în peptide, ne dăm seama că metoda Edman va fi capabilă să facă față unei minorități de pete de proteine ​​​​vizualizate pe un gel bun.

„Cerul înstelat” al electroforezei bidimensionale este primul și ultimul mod de a vedea proteomul cu proprii tăi ochi. Mai mult, cu o tehnică de înaltă calitate, ochiul uman este suficient pentru a detecta diferențele dintre plăcile de gel similare. Metodele ulterioare de proteomică, care vor fi discutate în continuare, formează „big data”, invizibile ca o zeitate. Această circumstanță păstrează în mare măsură popularitatea metodei „2-D”, care este folosită și astăzi, deși nu la fel de des ca înainte. Cu toate acestea, echipamentele sunt încă disponibile pentru vânzare și software pentru întregul ciclu de implementare a acestei tehnici.

Potrivit impresiilor personale, electroforeza proteinelor bidimensionale este una dintre cele mai laborioase și complexe proceduri biochimice de efectuat, care utilizează zeci de etape, reactivi și mai multe tipuri de echipamente de laborator. În laborator, i-am numit în glumă pe cei care efectuează electroforeza bidimensională „artişti proteomici”. Într-adevăr, instalarea metodei durează două până la trei zile și necesită o concentrare semnificativă în toate etapele sale. Cea mai mică greșeală duce la o denaturare semnificativă a „imaginei” de pe gel. Metoda nu este complet automatizată, ceea ce a fost unul dintre motivele scăderii popularității sale. Cu toate acestea, a primit un al doilea vânt la începutul secolului, când genomul complet a izbucnit în știință, iar după aceasta, proteomica. spectrometrie de masa .

Diaem: echipament modern pentru analiza proteomica

Material furnizat de partenerul nostru - compania Diaem

Partea 2. Postgenomul

Proteomica ca tehnologie post-genomică

Apariția secvențelor genomului dintr-o varietate de organisme, variind de la bacterii până la genomuri mari de plante și animale (inclusiv oameni), a redus spațiul de căutare pentru identificarea proteinelor. Cu excepția situației cu secvențierea ADN-ului total al unui amestec complex de organisme (așa-numitele metagenom sol, conținut intestinal, apele oceanice etc.), biochimiștii au de obicei o idee despre tipul de organism pe care îl analizează. Și asta înseamnă că proteinele din proba studiată sunt sintetizate folosind fluxul de informații din genele acestui organism care le codifică. De fapt, așa este termenul „ proteom „- în 1994, Mark Wilkins, un student absolvent australian, a propus ca acesta să se refere la o proteină sau o adiție de proteine ​​la genom. Genomul – genomul citit – a dat naștere „-om-urilor” rămase, iar tehnologiile care permit analizarea lor, aproape ipotetică la sfârșitul anilor 1990, au format un grup postgenomic , sau, așa cum sunt adesea numite acum, tehnologii omice .

Vorbește adevărat, gândește-te, domnilor, studenți absolvenți.

Strict vorbind, adevărata omică este analiza produselor transferului de informații genomice, adică ARN și proteine ​​care codifică și necodifică. Alte omice sunt în esență indirecte. Ele nu sunt conectate cu codul genetic printr-un flux direct de informații și sunt combinate în grupuri în funcție de natura chimică a compușilor analizați. Este de remarcat faptul că tehnologiile omice efectuează analize simultane a mii de compuși, de exemplu, metaboliți, lipide, glicani etc. și se numesc, respectiv, metabolomică, lipidomică (se suprapun parțial), glicomică etc. Entuziaștii ultimului deceniu - epoca sloganurilor și a memelor - au venit cu un număr incredibil de „omic-uri”, inclusiv unele destul de comice. Până în 2010, numărul de utilizări diferite ale sufixului „omics” sau „omics” a depășit două sute, ceea ce a permis chiar și „civililor” să glumească pe această temă. Wall Street Journal, care a numit procesul „cresingomics”.

Fenomenul spectrometriei de masă la oameni proteici

Măsurarea precisă a greutății moleculare a unui compus chimic este un obiectiv dorit al tehnologiei analitice. Într-adevăr, aceste cunoștințe rezolvă multe probleme și, uneori, cu informații suplimentare, oferă identificarea substanței căutate. Spectrometrie de masa - un set de metode care vizează măsurarea greutății moleculare a compușilor. Această abordare s-a dezvoltat încă de la sfârșitul secolului al XIX-lea, când Sir Joseph John Thomson a reușit să creeze un spectrograf de masă constând dintr-un tub cu descărcare în gaze care separa particulele încărcate cu greutăți moleculare diferite de-a lungul traiectoriilor lor. Apoi Arthur Dempster s-a dezvoltat... Dar oprește-te! Este imposibil să acoperiți întreaga istorie a spectrometriei de masă în acest articol și nu este nevoie, deoarece a fost făcut de multe ori de către profesioniști. În calitate de biochimist de pregătire, este potrivit pentru mine să ofer o privire de ansamblu asupra acestui domeniu fascinant într-un context biologic pentru a acoperi decalajul dintre ingineria fizică complexă și aplicațiile sale biomedicale.

Noi, biologii, trebuie să credem că nu există altă modalitate de a măsura masa moleculară decât prin a face moleculele în mișcare. Și imediat după aceasta vom crede că moleculele pot fi făcute să se miște doar într-o formă încărcată, adică transformându-le în ioni. Deci prima etapă a analizei spectrometrice de masă (Fig. 5) este ionizarea. Primele metode de ionizare au fost dure, astfel încât macromoleculele nu s-au păstrat în ele. Succesele spectrometriei de masă în biologie, după cum va fi clar din cele ce urmează, sunt asociate cu capacitatea de a ioniza biomolecule fără a le distruge. După ionizare, compușii analizați sub influența unui câmp electric trebuie mutați într-un detector, care va potrivi caracteristicile mișcării moleculelor într-un câmp electromagnetic cu greutatea lor moleculară sau, mai precis, cu raportul dintre greutatea moleculară și sarcină. . Mai simplu spus, dacă două molecule diferite poartă aceeași sarcină, dar diferă în masă, aplicarea aceluiași câmp electric le va face să zboare diferit. Dacă antrenați, adică calibrați detectorul folosind standarde cu mase cunoscute, puteți, prin estimarea mișcării ionilor necunoscuți, să determinați raportul lor masă-încărcare. Dacă sarcina este egală cu unitatea (adică avem de-a face cu ioni încărcați individual), raportul este numeric egal cu greutatea moleculară.

Spectrometria de masă este astăzi un domeniu gigantic, utilizat activ în aproape toate domeniile industriei, în chimie, biologie, medicină și protecția mediului. Mai mult, în Proiectul Manhattan și, probabil, în proiectele nucleare sovietice, uraniul radioactiv a fost îmbogățit cu ajutorul unui spectrometru de masă, separându-l în izotopi. Cel mai mare forum despre spectrometria de masă, conferința Societății Americane de Spectrometrie de Masă, atrage anual până la 15 mii de participanți. Ponderea metodelor biomedicale în spectrometria de masă continuă să crească odată cu investițiile în biotehnologie în general.

Blestemul distribuției izotopice

Crearea spectrometrelor de masă a coincis cu descoperirea diferiților izotopi în elementele chimice. Când rezolvăm probleme chimice la școală sau desfășurăm diverse experimente biologice, adesea nu credem că elementele importante care alcătuiesc substanțele organice (C, O, N, S) conțin o proporție semnificativă de izotopi stabili care diferă ca masă de cei nominali. indicate în tabelul periodic. Biologii se confruntă cu izotopi radioactivi, care până de curând erau utilizați pentru a marca biomolecule. Arheologii și paleontologii sunt bine conștienți de problema izotopilor stabili și radioactivi - îi folosesc pentru a-și data descoperirile. Dar în majoritatea experimentelor de biologie moleculară nu este nevoie să ne amintim aceste impurități.

Raportul de izotop stabil pentru fiecare element este o proprietate a materialelor. Interesant este că astfel de rapoarte ale izotopilor stabili variază în diferite medii, de exemplu, în apa dulce și de mare, în roci și, de asemenea, în diferite perioade ale existenței Pământului și a altor corpuri cerești. Prin urmare, măsurarea acestui parametru în diferite condiții prezintă un interes serios în diverse domenii ale științelor naturii. Dar pentru studierea maselor exacte de proteine ​​și peptide în proteomică, existența izotopilor stabili este un blestem.

Pentru a simplifica, să presupunem că compusul pe care îl măsurăm conține doar un amestec de izotop stabil al carbonului - 13 C. Ponderea sa în masa carbonului total de pe planetă este de aproximativ 1%. Astfel, dacă molecula noastră are 10 atomi de carbon, iar greutatea sa moleculară nominală, conform tabelului periodic, este, să zicem, 152 de unități de masă atomică, numai fiecare a zecea moleculă va conține un atom „greu” de C. Și molecula noastră va avea o greutate moleculară de nu 152 și aproximativ 153 Da. Astfel, spectrometrul de masă dintr-un compus va înregistra nu un vârf, ci mai multe. Prima va conține masa nominală împărțită la sarcina (m/z) - la o unitate de sarcină - 152, a doua - de 10 ori mai mică ca intensitate, ceea ce reflectă pur și simplu numărul relativ de molecule cu o astfel de masă, cu m/z = 153 Da. Deoarece, conform statisticilor, vor exista molecule cu doi sau mai mulți atomi „grei”, vârfurile lor pot fi și ele în spectru, dar din cauza intensității lor scăzute este posibil să nu depășească sensibilitatea detectorului.

Spectrometrele de masă moderne sunt capabile să rezolve vârfuri cu diferențe de masă moleculară mult mai mici decât 1 Da.

Acum imaginați-vă un compus similar, dar va include deja 100 de atomi de carbon. Fie greutatea sa moleculară nominală de 1502 Da. Este ușor de înțeles că numărul de molecule care conțin cel puțin un atom „greu” în acest caz îl va depăși pe cel cu o greutate moleculară nominală. Dintre câteva vârfuri care vor corespunde unui număr diferit de atomi ale izotopului 13 C, cel mai mare în acest caz va fi al doilea vârf, cu m/z aproximativ egal cu 1503 Da. Ce se va întâmpla dacă luăm spectrul de masă al unui compus de mărimea unei proteine ​​mici, cu o masă de peste 10.000 Da? Un număr semnificativ de molecule identice din punct de vedere chimic, dar diferite ca compoziție izotopică, formează o întreagă pădure de vârfuri în spectrul de masă, iar cele mai intense dintre ele vor fi situate departe la mijlocul acestui set de vârfuri și în greutate moleculară. va diferi semnificativ de nominalul, așa-numitul greutate moleculară monoizotopică conexiuni (Fig. 6). De exemplu, masa monoizotopică a albuminei din zer bovin, standardul proteic atât de îndrăgit de biochimiști, este de 66.389,86 Da, în timp ce masa „medie”, corespunzătoare celui mai intens vârf din spectrul de masă, este cu aproximativ 43 Da mai mare!

Se acumulează informații despre comportamentul diferit al izotopilor stabili ai aceluiași element în procesele chimice și biologice. Cu toate acestea, în majoritatea cazurilor se presupune că proprietățile compușilor cu aceeași structură cu compoziții izotopice diferite sunt aceleași.

Figura 6. Scheme de distribuție izotopică a moleculelor de la metaboliți cu greutate moleculară mică la proteine. Cu cât ionul este mai greu, cu atât intensitatea celui mai înalt vârf este mai mică. Semn roșu Se arată masa monoizotopică - se calculează ca și cum numai izotopul principal ar fi prezent în substanță.

Numărul de ioni ai fiecărei substanțe transferați la detectorul spectrometrului de masă este aparent suma intensităților tuturor vârfurilor izotopice asociate compusului. Această cantitate poate fi exprimată și ca aria de sub tangentă care trece de-a lungul vârfurilor acestor vârfuri. Să ne imaginăm că detectorul a primit câteva mii de ioni de aminoacizi cu o greutate de 150 Da și același număr de ioni de proteine ​​cu o greutate de 15.000 Da. Aminoacidul va da 2-3 vârfuri principale, foarte înalte, primul fiind cel mai intens, iar proteina - câteva zeci, dar mult mai jos, cu vârful acestui deal blând undeva la mijloc. Este clar că o stâncă înaltă care se află în mijlocul unei stepe plate este mult mai ușor de observat decât un mic deal, ale cărui margini se îmbină și cu iarba înaltă - zgomotul tehnic care însoțește înregistrarea spectrului de masă.

Deci, sensibilitatea unui spectrometru de masă este caracterizată printr-o relație inversă cu greutatea moleculară a compusului analizat. Cu cât această masă este mai mare, cu atât este mai puțin intens vârful maxim dintre toate variantele izotopice ale compusului. În plus, numărul mare al acestor vârfuri face ca spectrul de masă să fie dificil de interpretat. De aceea, în proteomica modernă, proteinele sunt cel mai adesea descompuse în peptide cu o greutate moleculară de 500–2500 Da înainte de analiză, denotând această abordare „proteomica de jos în sus” ( de jos în sus). Aceste peptide sunt convenabile de analizat într-un spectrometru de masă. Digestia proteinelor este de obicei efectuată de cele mai specifice dintre proteaze - tripsină, care cu specificitate mare realizează proteoliza la legătura peptidică din dreapta resturilor de lizină și arginină. Eu numesc nevoia de a descompune proteinele un blestem pentru că are ca rezultat o pierdere de informații. În conductele proteomice moderne, unde o astfel de digestie se efectuează fără separare prealabilă, proteinele după analiză trebuie reasamblate, desigur, nu fără eroare. Situația amintește de asamblarea secvențelor de nucleotide după secvențierea de generație următoare, dar aceasta din urmă are un avantaj, deoarece fragmentele se suprapun unele cu altele mult mai des.

În ciuda confuziei enorme în spectrele de masă ale proteinelor mari, mulți cercetători continuă să lucreze cu ele fără clivaj. Această abordare se numește proteomică de sus în jos ( de sus în jos). Pentru a obține spectre de masă de înaltă calitate ale proteinelor întregi, se folosesc detectoare puternice de ultra-înaltă rezoluție. Cu toate acestea, nu a fost încă posibilă crearea unei metode de sus în jos, care analizează în mod fiabil și reproductibil proteinele în întregul proteom.

Spectrometrie de masă MALDI-TOF și amprentare cu peptide

În anii 1980, spectrometria de masă a început să dezvolte o abordare a ionizării moleculelor cu un laser în timpul cocristalizării lor cu o substanță organică sensibilă la lumină - așa-numita matrice. Matricea înconjoară moleculele substanței analizate, iar atunci când este iluminată de un laser de o anumită lungime de undă, își absoarbe energia, se ionizează singură și este capabilă - printr-un mecanism care nu este încă în întregime clar - să ionizeze eficient moleculele învecinate ale substanței. . S-a dovedit că, în anumite condiții, acest tip de ionizare - desorbție-ionizare laser mediată de matrice (ionizare cu desorbție laser asistată de matrice , MALDI ) - asigură ionizarea biomoleculelor fără dezintegrarea acestora. Imediat ce acest lucru a devenit clar, metoda a izbucnit în biologie, iar unul dintre autorii ei, care a fost primul care a arătat MALDI pentru proteine, japonezul Koichi Tanaka, a primit Premiul Nobel pentru Chimie în 2002. Ionizarea MALDI a fost combinată cu un detector simplu spectrometric de masă - ora zborului (ora zborului , TOF ), în care ionii zboară într-un tub vid, ajungând la un detector sub forma unei plăci sensibile la ioni (fotomultiplicator) (Fig. 7). Timpul necesar ionilor cu aceeași sarcină pentru a parcurge lungimea tubului va fi invers proporțional cu greutatea lor moleculară.

De obicei, matricele sunt acizi organici cu greutate moleculară mică, derivați ai acizilor cinamic, benzoic și alți acizi.

Împreună cu John Fenn, care a folosit ionizarea electrospray pentru biomolecule și Kurt Wüthrich (în general pentru RMN). Este de remarcat faptul că cercetarea lui K. Tanaka a fost făcută publică sub forma unui brevet, iar articolul său principal a fost publicat într-un modest jurnal de specialitate Comunicații rapide ale spectrometriei de masă. El însuși - inginer de cercetare într-o companie privată - nu a avut gradul stiintific. Ca și în multe alte cazuri, a existat controversă în acordarea premiului lui Tanaka. În același timp, germanii Franz Gyllenkamp și Michael Karas au adus o contribuție majoră la aplicarea MALDI pentru proteine.

În anii 1990 și începutul anilor 2000, spectrometrul de masă MALDI-TOF, simplu și fiabil, a devenit unul dintre calitățile proteomice. După cum s-a menționat mai sus, metoda principală pentru separarea proteinelor la scară proteomă la acel moment era electroforeza bidimensională. Dacă dintr-un gel o pată care conține o anumită puritate este excizată și proteina denaturată legată de gel este digerată cu tripsină, colecția de peptide din această proteină izolată va forma un set mai mult sau mai puțin unic de mase moleculare - cel puțin în un singur proteom. Acest lucru se datorează în primul rând specificității ridicate a tripsinei și distribuției unice a lizinei și argininei la care clivajul are loc în secvențe diferite. Setul de mase de peptide ale fiecărei proteine ​​le-a reamintit cercetătorilor să folosească amprentele digitale pentru identificarea personală, așa că noua abordare a fost numită cartografierea peptidelor spectrometrice de masă , amprenta peptidică , sau, cum este mai bine să spunem în rusă, amprentarea cu peptide (Fig. 8) .

Ideea unei hărți peptidice a unei proteine ​​a venit la spectrometria de masă prin cromatografia lichidă de înaltă performanță dezvoltată atunci. Proteinele purificate ar putea fi scindate în peptide de către o protează, iar analiza lor pe un cromatograf a oferit o hartă unică a peptidelor. Dacă determinați timpul standardizat de eliberare a fiecăreia dintre peptide din coloana cromatografică, proteina poate fi identificată dintr-o astfel de hartă cromatografică a peptidelor. Acum s-a decis înlocuirea unui astfel de parametru precum timpul de eliberare cu un indicator mai precis și mai ușor de formalizat - raportul masă-încărcare al ionului peptidic determinat într-un spectrometru de masă.

Cum putem evalua formal corespondența dintre spectrul de masă observat și ideile teoretice despre secvențele de proteine? În primul rând, este necesar să „cliviți” toate proteinele virtual cu tripsină și să compilați o bază de date din ele pentru a le compara cu spectre. Aici proteomica devine postgenomică - pentru că fără secvențe teoretice, vor exista prea multe combinații, iar prezicerea unei potriviri nu va mai fi posibilă. În continuare, este necesară o metodă pentru a estima probabilitatea ca un set observat de peptide să aparțină unei anumite proteine. În primul exemplu de realizare, această problemă a fost rezolvată prin calcularea probabilității ca un set de vârfuri să nu fie aleatoriu. Dacă cineva își amintește de la un curs de statistică, probabilități similare sunt calculate atunci când bile de diferite culori sunt scoase orbește dintr-o pungă. În cazul nostru, trebuie să răspundem la întrebarea: au fost bile de peptide din anumite mase turnate aleatoriu în spectrul nostru dintr-o pungă mare cu toate posibilitățile? Dacă coincidența este foarte non-aleatorie, sistemul atribuie un coeficient de probabilitate mare spectrului nostru ( Scor).

Unul dintre primii algoritmi de amprentare cu peptide a fost MOWSE, care a stat la baza programului Mascot, larg cunoscut specialiştilor. Aș dori să atrag atenția asupra unui punct important în dezvoltarea analizei proteomice. De la introducerea amprentei cu peptide, identificarea proteinelor și a peptidelor a evoluat de la măsurare la predicție. Astfel, fiecare proteină identificată prin această metodă este caracterizată de un parametru de probabilitate calculat că este cu adevărat ea. Când colorăm un gel cu anticorpi, prezența petelor pe un Western blot nu ne va spune așa ceva. Astfel, proteomica a intrat în era „motoarelor de căutare” - programe care compară secvențele teoretice preluate din genom cu spectrele de masă observate și returnează probabilitatea ca aceste spectre să fi fost obținute din proteinele și peptidele corespunzătoare.

Amprentarea cu peptide este o metodă de analiză a proteinelor descompuse. În paralel, MALDI-TOF a început să fie folosit pentru a studia proteine ​​întregi în amestecuri complexe - într-o analiză de sus în jos. Profilele proteice ale sângelui pacienților cu diferite boli, diferite celule bacteriene și eucariote au fost analizate în întregime și spectrele de masă rezultate au fost comparate în diferite grupuri în scopul diagnosticării clinice și identificării diferitelor stări. Spectrul de masă a fost folosit ca imagine, antrenând algoritmi pe cazuri cunoscute și recunoscând efectiv cazuri noi. Dacă utilizarea acestei abordări pentru analiza proteinelor din sânge în diagnosticul tumorilor maligne nu a fost suficient de fiabilă pentru implementare, metoda de analiză a celulelor bacteriene întregi a devenit mai de succes și este acum utilizată în clinici. Metodele implementate pe un spectrometru de masă foarte simplu și algoritmii special antrenați atașați la acesta sunt capabili să identifice microorganismele patogene până la specii și gen, cu analiza MALDI-TOF aplicată celulelor bacteriene întregi. Acestea sunt aplicate unei ținte metalice a unui spectrometru de masă, acoperite cu o matrice și iradiate cu un laser pentru a obține profile specifice recunoscute de un algoritm bazat pe masele lor caracteristice.

Spectre de masă în tandem și căutare proteomică

Scoaterea bilelor colorate din punga prăfuită a continuat atunci când spectrometrele de masă au învățat să fragmenteze peptidele în condiții blânde. În interiorul unor detectoare, ionii de peptide și alți compuși sunt supuși unor influențe speciale, de exemplu, ciocniri cu molecule neîncărcate de gaze inerte, în urma cărora acești ioni se disociază, formând un set de fragmente (pentru mai multe detalii, vezi Fig. 9). ). După disociere, se pot măsura și masele fragmentelor. Acum că am învățat să punem în aplicare analiza tandem , sau MS-MS , fiecare peptidă este caracterizată de masa unui ion precursor, care este uneori numit ion „părinte” și un set de mase de ioni de fragment (ioni „fiice”).

Figura 9. Spectrometrie de masă în tandem. Diagrama metodei - sus. Principalele tipuri de fragmente care se formează în timpul disocierii peptidelor în interiorul spectrometrului de masă sunt în partea de jos. Deoarece peptidele au aceeași structură, în condiții selectate de disociere de coliziune, ele sunt distruse la anumite legături într-un mod previzibil. Lanțul peptidic se poate rupe la legătura dintre primul și al doilea atom de carbon (alfa) dintr-un aminoacid, producând ioni a- și x la dreapta și la stânga legăturii rupte. În mod similar, atunci când o legătură peptidică este ruptă, apar ioni b- și y, iar când legătura dintre un atom de azot și un atom de carbon α este ruptă, apar ionii c- și respectiv z.

Deci, din secvența peptidei, putem presupune masele moleculare ale principalelor tipuri de fragmente formate din aceasta în timpul disocierii într-un spectrometru de masă. La fel ca în amprentarea peptidelor, o secvență de proteine ​​este împărțită în peptide și masele peptidelor teoretice sunt comparate cu cele observate în spectru, aici este posibil să comparăm fragmentele teoretice ale fiecărei peptide virtuale cu vârfurile observate ale masei tandem. spectru. Cu alte cuvinte, întregul genom de codificare in Silicon este împărțit în peptide folosind, de exemplu, tripsina, pentru fiecare dintre ele fiind construit un spectru de fragmentare teoretic conform regulilor empirice cunoscute. Acum, astfel de spectre de masă teoretice pot fi comparate cu cele reale și pot calcula cumva probabilitatea ca aceasta să fie exact peptida potrivită. Unitatea de predicție a secvențelor din spectre de masă este acum o pereche peptidă teoretică - spectru real (potrivire peptidă-spectru, PSM). Este evident că multe spectre, mai ales în cazul unui proteom mare (de exemplu, cel uman), pot forma perechi cu mai multe peptide teoretice, dintre care trebuie selectate cele mai bune.

Construirea de motoare de căutare pentru spectrometria de masă în tandem este un domeniu imens și au fost dezvoltate zeci de astfel de instrumente. Printre acestea, din fericire, există programe open source, iar eu sunt un susținător al utilizării tocmai a unui astfel de software în știință. Este puțin probabil să reușim să înțelegem complexitățile de eliminare a PSM-urilor corecte în acest articol. Voi spune doar că o realizare semnificativă a căutărilor proteomice folosind spectre de masă în tandem a fost invenția în 2007 a abordării (Fig. 10), în care să peptide reale, teoretice genomice ( vizate - ţintă) la interpretarea spectrelor de masă, au început să adauge o cantitate egală de peptide false, fără sens, formate special ( fals - momeală). Când, printre cele mai bune PSM, algoritmul începe să returneze potriviri la peptide despre care se știe că sunt inexistente, putem opri procesul și putem determina rata fals pozitive (FDR) în datele noastre proteomice. Adică, predicțiile noastre conțin întotdeauna un mic amestec de minciuni, ceea ce este inevitabil în căutările proteomice de acest tip. Lucrul normal este că putem estima cel puțin proporția de identificări false.

Nu mi-ar plăcea să denigrez afacerea cuiva, dar folosirea unui instrument scump în știință fără să știu cum funcționează, în opinia mea, contrazice însăși ideea de a dezvolta gândirea științifică.

Figura 10. Principiul confirmării rezultatelor unei căutări proteomice . Testarea ipotezelor despre coincidența spectrului real cu cel teoretic duce la formarea perechilor spectru-peptidă (PSM). Algoritmul de căutare atribuie fiecărui spectru real cea mai bună peptidă, în opinia sa. Dar autorii metodei au înșelat - au adăugat peptide reale la spectrele teoretice ( ţintă) fals, evident inadecvat ( momeală). Și când peptidele momeală încep să corespundă spectrelor, acestea sunt erori evidente, adică rezultate fals pozitive. Așteptăm până când proporția de PSM cu aceste momeli - așa-numita rată a fals pozitive (FDR) - atinge o anumită valoare (de obicei 1%) și oprim căutarea. Acum știm aproximativ câte erori avem între identificările PSM „corecte”, deoarece probabilitatea de a greși față de țintă este egală cu cea față de momeală.

Invenţia peptidei MS/MS acceptabile şi apariţia metodelor de procesare a unor astfel de date au făcut posibilă livrarea amestecurilor de peptide la spectrometrul de masă fără a separa proteinele întregi. Adică, a devenit posibil să se descompună toate proteinele dintr-o probă cu o protează și să se opereze cu un set de peptide, mai degrabă decât cu proteine. A apărut proteomica puștilor (proteomica puștilor ), care, de dragul eufoniei, în detrimentul acurateței, este tradus în rusă ca foc rapid sau panoramic .

Ionizare prin electrospray și proteomică cu foc rapid

Unul dintre câștigătorii Premiului Nobel 2002, pe care l-am menționat mai sus, a fost chimistul american John Fenn. Anterior, el a propus să-l folosească în spectrometria de masă metoda de ionizare prin electrospray , sau, cum se mai spune, electrospray (ionizare prin electrospray , ESI ). Când se aplică o tensiune înaltă lichidului care părăsește capilarul conic, acesta se transformă într-un aerosol și când lichidul se evaporă din particulele de aerosoli (de exemplu, într-un flux de gaz inert) incarcare electrica se poate transfera la biomolecule dizolvate în acest aerosol. Acest lucru asigură o ionizare moale la presiunea atmosferică, care aproape că nu fragmentează compușii cu molecule înalte, spre deosebire de multe metode de ionizare utilizate anterior. Nu fără simțul umorului britanic, Fenn, în articolele și prelegerile sale, a comparat alegoric biomoleculele pe care le-a făcut să se înalțe folosind metoda sa cu elefanții zburători (Fig. 11).

Ionizarea prin electrospray s-a dovedit a fi neobișnuit de convenabilă pentru combinarea a două metode importante de biochimie analitică - cromatografia lichidă de înaltă performanță și spectrometria de masă. Acum fluxul fazei cromatografice din coloana analitică ar putea fi direcționat într-un con pentru electrospray, sau un astfel de con ar putea fi aranjat la capătul coloanei, iar spectrometrul de masă ar putea fi folosit ca analizor de molecule separate în coloană. . Capacitatea de a efectua spectrometrie de masă în tandem, împreună cu dezvoltarea căutărilor proteomice de la mijlocul anilor 2000, a făcut combinarea metodelor sub un acronim cu mai multe etaje. HPLC-ESI-MS/MS , sau pur și simplu LC-MS/MS , modalitatea preferată de a studia proteomul. Acesta este unul proteomica cu foc rapid (Fig. 12). A fost puțin dezamăgitor faptul că pentru a o implementa, de regulă, este necesar să se împartă întregul proteom sau fracțiile sale în peptide tripsină, pierzând astfel informații despre proteinele întregi. Cu toate acestea, bonusurile de la introducerea acestei abordări s-au dovedit a fi mult mai mari.

„democratizarea” spectrometrelor de masă de înaltă rezoluție a fost de mare ajutor pentru creșterea conținutului de informații al proteomicei cu foc rapid. Anterior, pentru o rezoluție deosebit de înaltă și o acuratețe a determinării, a fost necesar să se construiască dispozitive de rezonanță cu ciclotron ionic cu transformata Fourier, care foloseau magneți supraconductori puternici cu o inducție a câmpului magnetic de peste 7 Tesla. În ultimul deceniu, alte tipuri de detectoare au atins performanțe comparabile. Exemple de astfel de dispozitive sunt detectoarele hibride de la diferiți producători, de exemplu, Spectrometre de masă cvadrupol cu ​​timp de zbor (Q-TOF ). Poziția dominantă printre spectrometrele de masă disponibile este ocupată de un tip special de capcană de ioni, care a apărut pe piață în 2005 - Orbitrap (Fig. 13). Mândria plăcută este trezită de faptul că creatorul acestei capcane este un fizician rus care lucrează la Thermo, absolvent al MEPhI Alexander Makarov.

Brevetul Thermo Orbitrap este programat să expire în curând, așa că ne putem aștepta ca prețul acestui tip de detector să continue să scadă.

Precizia determinărilor masei moleculare în analizele proteomice de rutină a atins 5 ppm (adică, 0,0005%) sau mai mică. Acest lucru a condus la progrese semnificative în numărul de proteine ​​identificate în proteom în acest fel. Astăzi, cele mai bune grupuri științifice raportează identificarea produselor proteice a 9-10 mii de gene, adică aproape jumătate din întregul genom de codificare, folosind proteomica cu foc rapid în liniile celulare și țesuturile umane. Este corect să subliniem că aceste cifre sunt atinse cu o rată fals pozitivă de 1%.

Analiza cantitativă și urme izotopice

Simpla identificare a proteinelor folosind metoda proteomică nu este suficientă în majoritatea cazurilor. Pentru a înțelege mecanismele proceselor biologice, sunt necesare date cantitative pentru a compara proteoamele celulelor și țesuturilor în diferite stări. Cel mai simplu mod este analiza unor indicatori ai cromatogramelor obținute în timpul rulărilor sistemului LC-MS/MS, echipat cu date spectrale. Această abordare se numește fără etichete (cuantificare fără etichete , LFQ ), deoarece nu necesită modificări speciale ale metodei de pregătire a probei. De exemplu, într-o probă de control, au fost înregistrate 200 de spectre din toate peptidele unei anumite proteine, iar într-o probă experimentală, 400. Se poate presupune că numărul de spectre înregistrate este proporțional cu concentrația de proteine ​​din probă. Pentru comparație, sunt utilizați și alți parametri ai spectrelor, de exemplu, valori normalizate ale intensității semnalului. Analiza cantitativă fără etichete a datelor proteomice este atractivă prin simplitatea sa și pentru aceasta au fost dezvoltate un număr mare de soluții software, inclusiv programe gratuite cu acces deschis, printre care astăzi cel mai popular este pachetul MaxQuant dezvoltat de grupul lui Matthias Mann. din Germania. Metodele fără etichete sunt imprecise și semi-cantitative, iar constatările făcute cu acestea trebuie verificate într-un alt mod, cum ar fi utilizarea Western blot.

Este o problemă diferită atunci când una dintre probele analizate sau toate sunt etichetate cu aceiași izotopi stabili discutați mai sus. Apoi, în spectrul de masă, vârfuri de aceeași natură chimică, dar care conțin cantități diferite de izotopi stabili, vor apărea unul lângă altul în spectre, separate printr-o distanță de-a lungul axei m/z în funcție de eticheta utilizată. Putem compara intensitățile vârfurilor experimentale și de control din apropiere și putem calcula cu precizie raportul dintre concentrațiile peptidelor și proteinelor corespunzătoare.

Au fost dezvoltate un număr mare de soluții tehnice care permit etichetarea izotopilor. În cazurile în care este posibil să se cultive celule în medii artificiale, este posibil să se eticheteze toate celulele unui grup de analiză folosind medii marcate cu izotopi. În unele cazuri, etichetele sunt introduse în timpul digestiei cu tripsină. Există etichete care se manifestă pe ionii precursori și, de asemenea, pe ionii fragment. Acestea din urmă permit adesea efectuarea analizei cantitative în modul multiplex, de exemplu, un set de etichete TMT de la Thermo asigură procesarea simultană a 11 eșantioane cu etichete diferite! Utilizarea etichetelor izotopice crește semnificativ acuratețea analitică a analizei cantitative, care în unele cazuri poate deveni absolută, adică determină concentrațiile exacte ale compușilor analizați. Cu toate acestea, un dezavantaj semnificativ în acest caz este costul analizei.

Costul unui kit pentru etichetarea mai multor mostre poate fi aproximativ dimensiunea medie a unui grant RFBR (!) - pentru cei care știu.

Analiza peptidelor țintite - Monitorizarea reacțiilor multiple

În sfârșit, merită menționată metoda analizei proteomice, care în funcția sa concurează cu metodele de determinare a proteinelor cu ajutorul anticorpilor. Odată ce știm ce peptidă care caracterizează o proteină întreagă pe care dorim să o măsurăm, putem configura spectrometrul de masă astfel încât să vadă în esență doar acea peptidă. Astfel, munca se desfășoară într-un mod dirijat (țintit). Pentru a face acest lucru, utilizați un dispozitiv cu un detector triplu cvadrupol. În esență, acestea sunt trei spectrometre de masă identice care stau unul lângă celălalt și își transferă ioni unul către celălalt. În primul, ionul precursor dorit este filtrat, adică peptida care ne interesează, în a doua - unde a fost inclus doar „produsul” nostru - suferă fragmentare, iar al treilea înregistrează 3-5 fragmente selectate de noi. anticipat. Analiza cantitativă se efectuează pe baza intensității fragmentelor.

Abordarea este cunoscută din analiza moleculelor mici și a început să fie utilizată pe scară largă pentru peptide la mijlocul anilor 2000 sub numele monitorizarea reacțiilor multiple » ( monitorizarea reacțiilor multiple , MRM ), sau " monitorizarea reacțiilor selectate » ( monitorizarea reacției selectate , SRM ) (Fig. 14) . Această metodă nu este potrivită pentru descoperirea de noi fenomene în proteom, dar oferă o analiză cantitativă fiabilă, în special folosind standarde sintetice marcate izotopic pentru peptidele de interes. MRM permite analiza mai multor peptide într-o singură rulare LC-MS/MS. Este poziționat ca un „imunotest spectrometric de masă” și își caută în prezent locul nu numai în știință, ci și în practica clinică și biotehnologică.

Proteomica folosind anticorpi și alte molecule de legare

Odată cu îmbunătățirea aplicării precise a lichidului pe un substrat, cu alte cuvinte, imprimarea diferitelor tipuri de microcipuri, imunotestele pentru proteine ​​au putut deveni miniaturizate. Simultan cu cipurile pentru hibridizarea acizilor nucleici, au apărut multe soluții tehnice pentru plasarea a sute sau mai mulți anticorpi la diferite proteine ​​pe substraturi solide. Această multiplicare a imunotestelor cunoscute, combinată cu diferite tehnici ingenioase pentru vizualizarea legării proteinelor țintă, a mutat testul cunoscut anterior în modul proteomic. Detectarea proteinelor într-un mod multiplu folosind molecule de legare specifice (de exemplu, anticorpi și fragmentele acestora) a dobândit acum forme atât de diverse încât este probabil necesar să se creeze un material separat pentru a le descrie. Nu sunt un expert în micromatrice de proteine, așa că voi lăsa altcuiva să facă asta.

Mai multe soluții tehnice în acest domeniu merită menționate. La noi, un grup condus de A.D. Mirzabekova a creat acum aproximativ 20 de ani microcipuri pe bază de hidrogel, inclusiv pentru analiza proteinelor, iar această tehnologie este încă în curs de dezvoltare la Institutul de Biologie Moleculară al Academiei Ruse de Științe. O alternativă la anticorpi pentru analiza proteinelor multiplex este aptameri - oligonucleotide de legare. Pe baza aptamerilor modificați chimic, compania americană Somalogic a creat microcipuri pentru analiza a peste o mie de proteine ​​umane. Astfel de cipuri sunt din ce în ce mai folosite pentru a căuta biomarkeri, ca alternativă la proteomica spectrometrică de masă.

Dacă vorbim despre anticorpi pentru analiza proteinelor la scara întregului genom, atunci nu putem să nu menționăm puternicul proiect suedez condus de Mathias Uhlen - „Atlasul proteinelor umane”. În timpul acestui proiect, s-au obținut anticorpi policlonali antipeptidici pentru majoritatea proteinelor umane, care au fost apoi utilizați pentru a colora un număr mare de țesuturi și celule. Cu costul unui efort semnificativ, a fost creată o bază de date mare care conține diagrame și imagini care ilustrează sinteza majorității proteinelor genomului în diferite organe și țesuturi.

Atunci când moleculele analizate interacționează cu biosenzorul, are loc o modificare a refracției fasciculului de lumină din interiorul biosenzorului, care este înregistrată de dispozitiv și afișată pe un monitor de computer sub formă de curbe de asociere-disociere.

Ce urmeaza?

La final, ar trebui să schițați perspectivele direcției despre care scrieți. Nu sunt prea sibil – de fapt, nu știu ce se va întâmpla în continuare. Dar o să vă spun. Toate omicele vor fi democratizate - tehnologia va funcționa și mai bine, iar costul analizei va scădea. Desigur, cu spectrometria de masă nu se va ajunge la soluții similare cu un secvențior de acid nucleic pe bază de nanopori, care costă deja foarte puțini bani. Totuși, acolo este nevoie de un vid, care este creat de o pompă. Ei bine, și alte electronice.

Probele vor fi supuse mai multor tipuri de analize omice simultan. Chiar și astăzi, în unele domenii, de exemplu în caracterizarea moleculară a tumorilor, probele tind să fie examinate cuprinzător, în așa-numita proteogenomica . Acest lucru este necesar pentru o clasificare îmbunătățită a probelor, ceea ce poate duce la un management mai eficient al bolii.

Efectuarea măsurătorilor moleculare din țesuturi omogenizate care conțin milioane sau cel puțin mii de celule este similară cu evaluarea temperaturii medii într-un spital. Dacă printre miile de celule zeci conțin proteine ​​unice, ținte importante pentru medicamente, biomarkeri sau alte funcționalități, semnalul de la acestea se va pierde pur și simplu în timpul unei astfel de analize. Prin urmare, trebuie să se dezvolte proteomica unicelulară . Trebuie remarcat că este mult mai dificil să facă acest lucru decât, de exemplu, transcriptomica, deoarece semnalul de la proteine ​​nu poate fi amplificat, ca acizii nucleici în reacțiile în lanț a polimerazei.

Ceea ce este, de asemenea, important: deja acum datele pe care le primește spectrometrul de masă sunt foarte mari - acestea par să fie Big Data. Și în mod clar nu sunt suficient interpretate. Tendința în viitorul apropiat este de a crește conținutul informațional al datelor proteomice. Într-o formă ușor regândită, se va aplica proverbul: „Doi cu un bipod (oameni care efectuează experimente și primesc date), șapte cu o lingură (informaticieni care prelucrează aceste date).” Și este mai bine să le eliminați pe primele două, lăsați roboții să lucreze pentru ei. Oamenii IT se vor întinde pe plajă cu laptopuri (le place asta) și îmi vor trimite date prelucrate, iar eu mă voi așeza pe o grămadă undeva într-un sat rusesc (deja îmi place asta) și voi scrie despre proteomi.

Și un ultim lucru. Cercetătorii sunt oameni stricti. Prin urmare, mă aștept la câteva comentarii critice la acest text, care nu este deloc cuprinzător. În articol pot exista și erori de fapt și tehnice. Rog pe toți să-și exprime părerile în comentarii și personal, suntem deschiși cooperării și cu siguranță vom corecta textul în cazul unor critici justificate.

Calendar